专利 CN101506238A （具有提高治疗活性的方法和成分）

摘要

通过改变Fc区寡糖的唾液酸化作用，控制含有Fc的蛋白质(例如抗体)的性质。改性的含有Fc的蛋白质在疾病和病症中具有治疗的实用性，预期其在疾病和病症中可控制对一种或多种FcγRI、FcγRIIA、和FcγRIIIA受体的亲和力、ADCC活性、巨噬细胞或单核细胞活化、血清半衰期、和亲合力。

说明

具有提高治疗活性的方法和成分

技术领域

本发明涉及与Fc受体相互作用的改性治疗蛋白质和生产改性治疗

蛋白质（例如抗体）的方法,致使寡糖链的成分可提高抗体对其靶标的亲 合力和改变受体结合亲和力并因此与未改性的抗体相比改变所述抗体 效应子功能活性。

背景技术

抗体为先天免疫中担任重要作用的可溶血清糖蛋白。所有天然产生 抗体的碳水化合物结构在重链恒定区保守位置随着同种型的不同而变化。各种同型具有不同排列的N-连接寡糖结构，其可不同地影响蛋白质 组装、分泌或功能活性(Wright, A.,和Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997))。参照图1和2,连4妻N-连接寡糖的结构依赖处理的程度 可相当大地变化，且可包括高甘露糖以及复合双触角的寡糖，可有或没 有二等分的GlcNAc和核心岩藻糖残基(Wnght, A.,和Morrison, S. L., supra)。 一般地，在特定糖基化位点连接核心寡糖结构具有异种的处理 方法，恰好使单克隆抗体存在多种糖形式。同样地，已经显示在产生抗 体的细胞系之间出现了抗体糖基化的主要差异，和甚至在不同培养条件 下生长的指定细胞系中观察到次要的差异。

已知聚糖上的唾液酸(静电基团（static groups))在延长除抗体之外的 糖蛋白的血清半衰期中是重要的（Stockert, R. J. (1995) Physiol. Rev. 75, 591-609)。到目前为止，单克隆抗体(Mab)上唾液酸的作用不是纟艮清楚的。 Mab的血清半衰期是尤其长的并证明了 Fc融合蛋白的构建在开发治疗 蛋白质例如蛋白质enteracept中是有用的策略。

抗体和T细胞受体分子具有负责特异细胞表面受体结合的区域，所 述结合调节细胞应答。免疫系统中，将这些功能归类为体液的和细胞的。 抗体常常指作衔接分子，连接体液和细胞的免疫机制:体液应答主要归因 于能与耙抗原高亲和结合的成熟的、分泌的、循环抗体。细胞应答归因 于细胞活化的结果，所述细胞活化可通过ab-ag复合体的结合和通过作 为复合体结合效应细胞的结果的细胞介质释放所引起的下游区结局而实现。这些细胞应答包括中和靶标、调理和敏化(如果抗原位于细胞表 面）、敏化肥大细胞、和活化补体。至于细胞耙标,即为，细胞表面抗原，这些效应子功能导致通常所称的抗体-依赖的细胞毒性(ADCC)和补体依 赖细胞毒性(CDC)。

在抗体同型（例如IgE、 IgD、 IgA、 IgM、和IgG)中，IgG类为最丰 富的，IgGl子类显示出效应子功能的最显著程度和排列。IgGl-型抗体是 癌症免疫疗法中最常用的抗体，其中ADCC和CDC活性常常被认为是 重要的。结构上，IgG铰链区和CH2域在抗体效应子功能中担任主要的 作用。Fc区中存在的N-连接寡糖(通过铰链二聚化形成的CH2和CH3 区域)影响效应子功能。共价结合的寡糖为复合双触角型结构且为高度异 种的（参见图1和2)。 Asn297中保守的N-连接糖基化位点位于每个CH2 区域。在成熟的抗体中，与Asn297连接的两个复合双触角寡糖埋在CH2 区域之间，构成与多肽骨架的广泛接触。据发现，它们的存在是抗体介 导效应子功能（例如ADCC)的要素（Lifely, M. R.,等，Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R.,等，Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright: A.和Morrison, S. L., supra)。

这些异种的寡糖包含作为末端糖的占优势的唾液酸、岩藻糖、半乳 糖和GlcNAc残基(Raju, T.S.，等.Glycobiology 2000. 10(5): 477-86)。已 经显示出这些末端糖中的一些例如暴露的半乳糖、核心岩藻糖和二等分 GlcNAc的残基，影响ADCC活性、CDC活性，也影响抗体对多种配体 包括Clq补体蛋白质的结合(Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol. 13(4):519-25)。虽然Fc中存在的多数N-连接寡糖本性为复合双触角的， 它们没有被唾液酸化至显著的程度(Idusogie EE,等.2000. J Immunol. 15:164(8):4178-84)。

人IgG和其它重组产生的IgG中发现的主要结构为有或没有Gal残 基暴露的复合双触角结构（图1)。已经详细研究了含末端Gal的结构对 抗体功能的生物学重要性的作用。抗体的半乳糖基化程度受到年龄、性 别和疾病的影响(Raju, T.S.，等.Glycobiology 2000. 10(5): 477-86)。 一般 而言，寡糖结构有一定程度的种特异性并广泛地变化。进一步地，也已 经研究了有和没有二等分GlcNAc和核心岩藻糖残基的寡糖结构对生物 学重要性的影响。人IgG和多数重组产生的IgG包含较小量的唾液酸化 的寡糖，然而极大多数IgG包含无唾液酸化的寡糖结构。Ab的Fc聚糖中的唾液酸对Fc功能影响的信息是有限的，部份是由 于不能利用成对的唾液酸含量显著不同的相同碱Mab。据报道，从抗癌 IgGl Campath-IH(阿仑单抗)上除去唾液酸对ADCC活性没有影响，但是 用作参照的最初Mab制品上的Fc聚糖基具有小于10%唾液酸化，使之 难于检测到任何效果(Boyd等.,1995)。相似地，Wright和Momson(1998) 报道在唾液酸化缺损的突变型CHO细胞系中表达的IgGl Ab和在野生型 CHO细胞系中表达相同的Ab之间没有可辨别的Fc y RI结合上的差异。 然而，来自野生型细胞系的Ab中存在的唾液酸量是相当4氐的（Wright 等.，2000)，因此也难于检测到唾液酸化和无唾液酸化的Ab之间的任何 结合差异。Mimura等.（2000)比较了天然的（异种的)IgGl-Fc和IgGl Ab 相对于用唾液酸酶和P -半乳糖苷酶两者但没有单用唾液酸酶处理后的 相同物质的Fc活性，单用唾液酸酶处理才可片企-睑唾液酸的影响。突变 和高唾液酸化(经oc2,3连接)的人IgG3 Ab(Lund等.，1996 supra)在补体 溶胞测定、和FcYRI-依赖的及FcyRn-依赖的功能测定中，比其野生型 低唾液酸化相似物^f氐2至3-倍的活性，4旦是含有混合两种唾液酸连接（a 2,3和oc2,6)的相同Ab的高唾液酸化变体具有比得上野生型的活性 (Jassal等.，2001 Biochem Biophys Res Comm 286:243-249)。虽然证实唾 液酸连接类型对突变型IgG3 Ab的Fc功能可至少具有一些影响，但研 究没有比较高含量唾液酸的IgG与低含量唾液酸的IgG的Fc功能。

因此，对寡糖结构中与免疫球蛋白恒定区连接的唾液酸成分作用的 系统分析是正当的。治疗抗体的预表达基因工程或表达后修饰的可用技 术给出后，该信息可用于提高和进一步匹配由该类型生物药剂学对邻近 的初始耙标和疾病适应证所诱出的细力包应答。

发明概述

本发明包含优化含Fc分子的体液和细胞免疫功能的方法，尤其为 抗体治疗法。

本发明包含控制含Fc分子性质的方法，其包含改变(对生型增加或 减少)Fc区寡糖的唾液酸化以控制分子对多种局部靶蛋白质的亲合力； 对一种或多种Fc y受体(例如Fc y ri、 Fc y riia、和Fc y riiia受体） 的亲和力；ADCC活性；巨噬细胞或单核细胞活化；和血清半衰期。

通过酶处理、酶改性分子、基因操纵分子、凝集素色语法、亲和色i普法、离子交换色语法、疏水作用色谱法、尺寸排阻色谱法、用于表达 蛋白质的细胞系的特定选择或基因工程、用于含有能修饰寡糖的酶或这酶的抑制剂的血清或环境(mileu)中产生含有Fc蛋白质的宿主细胞培 养，和将蛋白质暴露给多种pH环境，可以改变聚糖唾液酸化作用。

本发明也涉及高度同种的批抗体的制备，所述抗体包含Fc区内最 大唾液酸化的N-连接寡糖。本发明进一步涉及批抗体的纯化，以富集含 唾液酸的Fc寡糖抗体以及不含唾液酸的Fc寡糖抗体。

更具体而言，本发明涉及宿主细胞或在细胞培养基或在体外操纵糖 基转移酶(唾液酸转移酶)或唾液酸酶活性的方法，以影响合成重组表达 单克隆抗体或其它含有Fc的融合蛋白的唾液酸化水平，所述方法使合 成重组表达蛋白质具有适当最佳化的（i)Fc介导的效应子功能，（ii)FcY 受体结合，（iii)改变的ADCC (lv)与重组表达的含有Fc^f旦没有优化唾液 酸含量的多肽相比的血清半衰期或(v)对位于天然或合成排列的靶分子 亲合力。

附图若干视图的简述 图1为人IgG中发现的最大量寡糖结构的概要叙述。 图2描述中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产的重组IgG中发现的主要寡 糖的结构。

图3展示HPLC检验Fc寡糖的结果。通过肽-N-聚糖酶F(PNGase F) 酶处理，N-连接寡糖首先从抗体中释放出来。将释放的寡糖用邻氨基苯 曱酸标记，并将标记的寡糖通过凝胶过滤色谱法纯化。将纯化标记的寡 糖通过HPLC分析，结果展示于色谱图中。

图4A和4B的曲线图展示不同Abl的结合:K562细胞上通过两种不 同形式对人FcyRII的免疫复合。（A)竟争结合，通过在固定量的与Ab6 复合的251-标记的人IgGl Ab5(Ab5特异性小鼠单克隆的Ab)存在下，向 细胞加入不同量的未标记的Abl和TNF的复合体进4于测量。（B)直接结 合，通过向K562细胞加入与]251-标记TNF复合的不同量的Abl进行测 量。

图5A-D为多种测试Ab制品的Fc y RIIIa结合实-验的曲线图，所述 制品用于竟争以固定浓度结合NK-细胞Fc y RIIIa的放射标记的抗Fc y RIIIa mAb 3G8:Abl天然糖基化变体(A);Ab5天然糖基化变体CB);Abl凝集素柱部分(C);和Ab2凝集素柱部分(D)。

图6A-D的曲线图展示在细胞表面过度表达TNF的K2耙细胞和表 达Fc Y R的人PBMC效应细胞上应用不同唾液酸含量的Abl进行的体 外ADCC测定的结果。（A)Abl天然糖基化变体，（B)Ab5天然糖基化变 体，（C)基于WGA凝集素亲和力分级分离的唾液酸含量不同的三子批 (sublot)Abl和酶脱糖基化的（Gno)Abl的比较,(D)未处理的Abl样品和完 全唾液酸化的Abl G2S2样品或Ab7同型配对的阴性对照Ab的比较。 以一式三份(误差条表示s.d.)分析样品，所示结果代表各对变体的三个独 立试验。当通过平方和增量(extra sum of squares)F检验确定时，这些测 试样品之间的活性差异是显著的（曲线图A、 C、和D， P〈0.0001;曲线 图B, P = 0.0016)。

图7A和B的曲线图展示多种IgG抗体样品在U-937细胞上对人Fc yRI (CD6々)受体的竟争性结合，（A) Abl G2(完全半乳糖化和无唾液酸 化)和AM G2S2(hi)(完全半乳糖化和完全唾液酸化)只有唾液酸存在和不 存在的差別,(B)两种不同批的带电荷不同量的寡糖种类（含有唾液酸的 种类）的Ab3,分别为总寡糖的2%或42%。

图8的曲线图展示施用后的时间和完全地唾液酸化(G2S2)或未改性 的Fc部分的融合蛋白（FcPl)的血清浓度之间的关系。

图9的曲线图按照所述的酶方法，展示施用后的时间和完全地唾液 酸化Ab2 G2S2或完全无唾液酸化Ab2 G2的Fc部分的血清浓度之间的 关系。

图10A-D的曲线图通过与放射标记的Ab竟争性结合，展示Ab制 品中的唾液酸对细胞表面耙配体的亲和力的影响:(A) Abl天然变体，（b) Ab5天然变体，（C)Abl凝集素-柱部分变体，和(D)Ab2凝集素柱部分变 体。样品以双份或四份进行试验，所示结果代表3或4个独立试验。当 通过平方和增量的F检验确定时，这些测试样品之间的结合差异是显著 的（曲线图A、 C、和D, P< 0.0001)。

图11A-B的曲线图展示Ab制品中的唾液酸对EIA板涂布的耙配体 的亲和力的影响:(A)与TNF结合的AM天然变体，（B)与抗Id抗体结合的 Ab2。

图12A-C为曲线图，展示Ab制品中的唾液酸对以放射标记的可溶 性表面结合Ab的抗原存在的靶配体的亲和力的影响:(A) Ab 1天然变体，(B)Abl 1凝集素-柱部分变体，和(C)Ab2凝集素-柱部分变体。进行放射 标记的Ag和100-倍过量未标记的Ag对照孵育，以测定非特异性结合。 样品以三份进行试验。

本发明详述

缩写

oc 1,3GT， a -1,3-半乳糖基转移酶；a 2,3ST, oc -2,3-唾液酸转移酶；P 1,4GT, |3 -1,4-半乳糖基转移酶;八0(^:,抗体-依赖的细胞毒性;八11(:(:,美国 标准培养收集所;BATDA,双（乙酰氧甲基)2,2':6',2"-三联吡啶-y,y"-二羧酸 盐;BSA,牛血清白蛋白;CD培养基，化学定义的培养基;CDC,补体直接的 细胞毒性；CMPSia,—磷酸胞苷-N-乙酰神经氨糖酸；DMEM,达尔伯克改 良伊格尔培养基;E:T,效应细胞对粑细胞的比例：FBS,胎牛血清；ESI-MS, 电喷射离子质谱法;NK细胞,天然杀伤细胞;IgG,免疫球蛋白G;IMDM,伊 思考夫改良达尔伯克培养基；MALDI-TOF-MS,基质辅助的激光/解吸电 离飞行时间质镨法；MHX,麦考酚酸,次黄噤呤、黄嘌呤；NANA,唾液酸 的N-乙酰神经氨糖酸的同分异构体;NGNA,唾液酸的N-羟乙酰基神经氨 酸的同分异构体;PBMC,外周血单核细胞；PBMC，外周（periphemll)血单 核细胞;PBS,磷酸緩冲盐溶液;PNGase F,肽-N-糖苷酶F;RP-HPLC,反相高 效液相色谱法；RT,室温；Sia,唾液酸；UDP-Gal,尿苷二磷酸-半乳 糖;UDP-Glc N Ac，尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。

定义

本文所用的术语"亲和力，，旨在表示筒单的单价配体（simple monovalent ligand)对其相应的结合配偶体的结合(例如Fab'对抗原或表 位的结合)常数的量度。亲和力可用几种方法测量，包括例如通过等离子 体共振法(BmCore)测量结合以及分离的速率(分別为k。n和koff),且亲和力可表达为全部締合(Kass)或解离常数(Ko),其中K^为k口koff和KD为koff/k。n。也可以经验地例如通过测量配体与结合配偶体为半饱和结合时 的浓度，測量Kd。测量KD的另一种方法为通过竟争测定法，其中将一 种结合剂或配体标记或标识并保持恒定的浓度，而以不同的浓度加入测 试结合剂或配体，以同标记物质竟争4吏之乂人其相应结合配偶体上离去并 测定标记物减少 一半时的浓度。

ii本文所用的术语"亲合力，，旨在表示配体保持与配偶体结合在配体 和结合配偶体两者多价结合范围内的趋向和对特异性配体可同时发生 多重締合和解离事件趋向的量度。因此亲合力通过增加已知亲和力的结 合配偶体的多价构造的表观亲和力，可测量亲合力。

本文所用的术语"含有Fc的蛋白质"或"含有Fc的分子"是指单体的、二聚体的或异二聚体的蛋白质，具有配体结合域和至少免疫球蛋白的CH2和CH3域。CH2和CH3域可至少形成该蛋白质/分子(例如抗 体)的二聚体区域的一部分。

术语"抗体"旨在包括抗体、消化片断、特定部分和其变体，其包 括但不限于抗体模拟物或包含模拟抗体或其特定片断或部分的结构和/ 或功能的抗体部分，其保留了Fc介导的功能，包括但不限于:结合Fc受 体（例如FcyRI (CD64)、 FcyRIIA (CD32A)、 Fc y RIIIA (CD16A)和 FcRn)、结合补体(例如Clq)、 ADCC和CDC。

本文所用的术语"单克隆抗体"为含有Fc融合蛋白的特异形式， 其中配体结合域保留至少 一种动物抗体的至少 一个重链或轻链抗体可 变域的基本同源性。

术语"唾液酸"是指九碳羧酸糖家族的任何成员。唾液酸家族最通 常的成员为仆乙酰神经氨酸(2-氧代-5-乙酰胺基-3,5-双脱氧-0-甘油隱0-半乳壬碳外匕喃糖-1 -酸(galactononulopyranos-1 -onic acid))(通常缩写为 Neu5Ac、 NeuAc、或NANA)。该家族第二个成员为N-羟乙酰基-神经氨 酸(NGNA、 Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基基团被羟基化。 该形式在啮齿类动物和微生物来源的糖蛋白中是普遍的。第三个唾液酸 家族成员为尤罗索尼克酸（2-氧代-3-脱氧-壬碳糖酸（nonulosonic acid))(KDN)(Nadano等.（1986)丄Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori等.，J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990))。也公开了 9-取代 的唾液酸例如9-0-C-C6酰基Neu5Ac,像9-0-乳酰基-Neu5Ac或9-0-乙酰基-Neu5Ac、 9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。至于 静电酸(static acid)家族的综述，参见例如，Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer Verlag, New York (1992))。

葛述出乎意料地发现了 Fc寡糖唾液酸化的水平可改变重组生产的治疗性抗体对FcY受体的亲和力，导致所述抗体生物作用的多方面调整。更 具体地说，发现了高度唾液酸化的Ab对低亲和性受体Fc y riia(cd32a) 和Fc Y RIIIA(CD1 6A)具有显著减少的亲和力，且在体外ADCC测定(据 相信Fc Y RIIIA为其中有关的受体）中具有显著减少的活性。进一 步发现 了高度唾液酸化的Ab对高亲和性Fc Y受体-Fc yRI(CD64)具有增加的亲 和力，且当与无唾液酸化或部分唾液酸化的含有Fc蛋白质比4支时，完 全唾液酸化的含有Fc的蛋白质具有降低的血清半衰期。

进一步发现了从Fc寡糖上除去（或缺失或降低的水平)唾液酸可提 高重组生产的治疗性抗体对其粑分子的亲合力。虽然不希望受限于任何 一种理论，可将从寡糖上除去带电荷的静电基团解释为使整体抗体结构 更具柔性，所述柔性在彼此联系的两个结合区域中提供潜在相互作用更 大的范围。Ab的二价(bivalently)结合两种抗原表位的能力也将依赖于表 位的可近性、方向、密度、和流动性。应当注意到唾液酸化对结合抗原 的影响也可与Ab相关，所述Ab识别病毒或细菌表面抗原和甚至为均聚 物的可溶性抗原，因为Ab柔性可决定可溶性免疫复合物内个体Ab分子 的二^j^结合程度的多少，其中一些Ab不^5l可以结合一种以上的抗原， 而且一些抗原可以;故一个以上的Ab结合。

本发明包含控制含Fc分子性质的方法，它通过改变Fc'寡糖的唾液 酸化作用和含改变的Fc分子。唾液酸在生理学pH时具有净负电荷，因 此在Fc结合的碳水化合物中唾液酸的存在预期会改变三维结构因而构 造ch2域,并因此影响Fc与多种配体或受体的结合。含有改变的Fc分 子可影响一种或多种FcyRI、 FcyRIIA、和FcyRIIIA受体的亲和 力,ADCC活性，巨噬细J包或单核细胞活化，和血清半衰期。

含有Fc蛋白质的唾液酸化形式的富集一种制备唾液酸含量不同的含有特定Fc的蛋白质子批的方法是取 具有异种Fc寡糖（包括唾液酸化和无唾液酸化两种分子）的含有Fc的蛋 白质制品，使之通过含有固定凝集素的柱，所述凝集素柱对唾液酸化和 无唾液酸化寡糖具有差别的亲和力。非结合流动经过(T,经过)或柱非结 合的部分可与结合部分(B,结合)分离，后者通过洗脱緩冲剂经过柱而收 集。例如通过在用初始样品緩冲剂连续清洗柱期间收集洗脱的含有Fc的蛋白质，也可能单独地收集弱结合部分或柱延滞部分(R,延滞)。取决 于所用的凝集素，非结合部分可比结合的部分具有更高或更低的唾液酸含量。

可富集含有唾液酸化和无唾液酸化Fc蛋白质的凝集素实例为怀槐 (Maacha awwrm^)凝集素(MAA),其特异地结合末端唾液酸寡糖；和 麦胚凝集素（WGA)其特异地结合末端唾液酸或末端N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)的寡糖。另一个实例为蓖麻凝集素(RCA),其与末端半乳糖寡 糖结合。在较后的实例中，非结合流动经过的部分可以用于富集含有唾 液酸化Fc的分子。

含有Fc的蛋白质的酶修饰

另制备唾液酸含量不同的含有特定Fc的蛋白质子批的方法是用唾 液酸酶处理含有Fc的蛋白质制品部分，从而除去唾液酸。可比较所得 到的无唾液酸化的物质与初始的、部分唾液酸化的物质在生物活性中的 差别。初始含有Fc的蛋白质批中唾液酸含量越高，检测到生物活性中 的任何差别的机会越大。例如，如果初始蛋白质制品只有10Q/qFc寡糖含 唾液酸，在唾液酸酶处理后（0-1%寡糖含唾液酸)可能难于纟企测到生物活 性中的差别。如果唾液酸酶处理导致岩藻糖化和无岩藻糖化 (afucosylated)的寡糖分布不同，那么比较含有Fc的蛋白质在唾液酸酶处 理前和后的生物活性将会更加困难，因为岩藻糖水平对某些生物活性诸 如对人FcyRIIIA的亲和性和ADCC活性具有极大的影响。例如，如果 将唾液酸含量从30%寡糖减少至0%,导致无岩藻糖化寡糖的比例从5% 增加至15%,那就不可能将ADCC活性的差别单独地归因于唾液酸含量 的减少。唾液酸酶处理可能影响岩藻糖化和无岩藻糖化寡糖的相对比例 (并且已经观察到），因为在用唾液酸酶处理以除去唾液酸残基之前，存 在岩藻糖化和岩藻糖化寡糖的唾液酸化差异。

存在于Fc区的唾液酸4匕寡糖也可应用体外糖基化方法来实现。应 用这种方法，可能获得抗体样品最大唾液酸化的糖形（glycoform)。基于 申请人的发现，当与无唾液酸化或唾液酸化不足的抗体相比时,抗体或其 它含有Fc构造的最大唾液酸化的糖形具有减少的血清半衰期。因此， 本发明的方法提供了控制包含抗方法。

糖基转移酶天然的功能是合成寡糖。它们产生特异的产物，具有极好的立体化学和区域化学几何学（regiochemical geometry)。糖基残基的 转移导致寡糖或多糖的延长或合成。已经描述了许多糖基转移酶类型， 包括唾液酸转移酶、岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、N-乙酰半乳糖 氨基转移酶、N-乙酰葡糖氨基转移酶等。

用于本发明的糖基转移酶包括例如oc -唾液酸转移酶、a -葡糖转移 酶、a-半乳糖基转移酶、cc-岩藻糖基转移酶、a-甘露糖基转移酶、a -木糖基转移酶、a -N-乙酰己糖氨基转移酶 (acetylhexosaminyltransfemses)、 p陽唾液酸转移酶、P-葡糖转移酶、P-半乳糖基转移酶、P-岩藻糖基转移酶、P-甘露糖基转移酶、P-木糖基 转移酶、和P-N-乙酰己糖氨基转移酶，例如来自脑膜炎奈瑟球菌 (Neisseria meningitides)或其它细菌源的那些糖基转移酶，和来自大鼠、 小鼠、兔、牛、猪、人类和昆虫病毒源的那些糖基转移酶。优选地，糖 基转移酶为其中切除结合膜的区域的平截变体糖基转移酶。

示例性半乳糖基转移酶包括ot (1,3)半乳糖基转移酶(E.G. No. 2.4.1.151,参见，例如，Dabkowski等.，Transplant Proc. 25:2921 (1993)和 Yamamoto等.Nature 345:229-233 (1990))和a (1,4)半乳糖基转移酶(E.C. No. 2.4.1.38)。可应用其它的糖基转移酶，例如唾液酸转移酶。

a(2,3)唾液酸转移酶通常称作唾液酸转移酶，可用于产生唾液酸乳 糖或更高级别的结构。该酶从CMP-唾液酸上转移唾液酸(NeuAc)至半乳 糖(Gal)残基，并在所述两个糖之间形成oc-连接。糖之间的键合(连接） 位于NeuAc的2-位和Gal的3-位之间。示例性oc (2,3)唾液酸转移酶是指 唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6),其将唾液酸转移至Gal P l—〉3Glc 二糖或糖 苷的非还原末端Gal的a(2,3)。参见，Van den Eijnden等，J. Biol. Chem., 256:3159 (1981), Wemstem等.，J. Biol. Chem., 257:13845 (1982)和Wen 等.，J. Biol. Chem., 267:21011 (1992)。另 一个示例性ct-2,3-唾液酸转移酶 (EC 2.4.99.4)将唾液酸转移至二糖或糖苦的非还原末端Gal。参见, Rearick等.，J. Biol. Chem., 254:4444 (1979)和Gillespie等.，J. Biol. Chem., 267:21004 (1992)。进一步的示例性酶包括Gal-P-1,4-GlcNAc a -2,6唾液酸转移酶(参见，Kurosawa等.Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994))。具体用于制备本发明寡糖的其它葡糖转移酶为甘露糖基转移酶包括a(l,2)甘露糖基转移酶、oc(l,3)甘露糖基转移酶、P(l,4)甘露糖基转 移酶、Dol-P-Man合酶、OChl、和Pmtl。

其它葡糖转移酶还包括N-乙酰半乳糖氨基转移酶包括oc(l，3)N-乙 酰半乳糖氨基转移酶、P (1,4)N-乙酰半乳糖氨基转移酶(Nagata等.J. Biol. Chem. 267:12082- 12089 (1992)和Smith等.J. Biol Chem. 269:15162 (1994))以及多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Homa等.J. Biol Chem. 268:12609 (1993))。适用的N-乙酰葡糖氨基转移酶包括GnTI (2.4.1.101, Hull等.，BBRC 176:608 (1991)), GnTII,和GnTIII (Hiara等. J. Biolchem. 113:692 (1993》，GnTV (Shoreiban等.J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993》。

至于其中以商业规模实施本方法的那些实施方案，将糖基转移酶固 定在支撑上可能是有利的。这种固定容易使酶从批产品中除去且有利于 酶以后的再使用。例如通过除去转移酶的膜结合区域并在其位置连接纤 维素结合区域，可以实现糖基转移酶的固定。本领域技术人员应当理解 也可以应用其它的固定方法，这些方法描述在可用的文献中。

因为受体底物基本上为含有对特定糖基转移酶显示特异性的末端 糖残基的任何单糖或寡糖，底物可以在其非还原端位置被取代。因此， 糖甙受体可以为单糖、寡糖、荧光标记的糖、或糖衍生物，诸如包括抗 体和其它含有Fc蛋白质的氨基糖甙抗生素、神经节糖苷或糖蛋白。在 一组优选的实施方案中，糖戒受体为寡糖，优选地，Gal p (l-3)GlcNAc、 Gal |3 (l-4)GlcNAc、 Gal P (l-3)Ga脆c、 Gal P (l-4)GalNAc、 Man a (1,3)Man、 Man a(l,6)Man、或GalNAc (5 (l-4)-甘露糖。在尤其优选的 实施方案中，寡糖受体与含有Fc的蛋白质的CH2区域连接。

通过应用与糖基转移酶（glycoltransferase)反应并发的再生反应（又 称再循环系统），可防止利用活化的糖底物即糖-核苷磷酸盐。例如美国 专利6，030,815中所教导的，CMP-唾液酸再循环系统利用CMP-唾液酸 合成酶来补充CMP-唾液酸(CMP-NeuAc),因为它在a (2,3)唾液酸转移 酶存在下与唾液酸转移酶受体反应，形成唾液酸化糖。本发明所用的 CMP唾液酸再生系统包含一磷酸胞苦(CMP)、三磷酸核苦(例如三石寿腺 苦(ATP)、磷酸盐供体(例如磷酸烯醇丙酮酸或乙酰磷酸)、能够从磷酸盐 供体转移磷酸盐至二磷酸核苦的激酶(例如丙酮酸激酶或醋酸盐激酶)以16及能够从三磷酸核苷转移末端磷酸盐至CMP的核苦单磷酸激酶(例如肌激酶）。oc(2,3)唾液酸转移酶和CMP唾液酸合成酶也可纟皮看作是CMP 唾液酸再生系统的 一部分，因为活化唾液酸的除去利于维持合成的推进 速度。1992年10月1日公布的国际申请WO 92/16640公开了应用包含 改性CMP唾液酸合成酶基因的噬菌粒在唾液酸化过程中的唾液酸化合 物合成和用途。

制备寡糖的替代选择性方法可如同美国专利5,952,203所教导，应 用糖基转移酶和作为糖供体的活化糖基衍生物，而不需要糖核苷酸作为 糖供体。活化的糖基衍生物用于替代天然存在的底物，所述底物为昂贵 的糖核苷酸，通常为核苷酸二磷酸糖或核苷酸单磷酸糖，其中核苷酸磷 酸盐与糖1-位置为cc-连接。

有用的活化的糖苷衍生物包括活化的离去基团，例如氟、氯、溴、 曱苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟曱磺酸酯（triflate ester)等。活化糖苷衍 生物的优选实施方案包括氟代糖（glycosyl fluorides)和曱磺酸糖基酯 (glycosyl mesylates),尤其优选的为氟代糖。在氟代糖中，最优选的为氟 代a-半乳糖、氟代a-甘露糖、氟代a-葡萄糖、氟代a-岩藻糖、氟代cx -木糖、氟代a-唾液酸、氟代a-N-乙酰氨基葡糖、氟代a-N-乙酰氨基半 乳糖、氟代P -半乳糖、氟代p -甘露糖、氟代P -葡萄糖、氟代P -岩藻糖、 氟代P -木糖、氟代P -唾液酸、氟代P -N-乙酰氨基葡糖和氟代P -N-乙酰 氨基半乳糖。

通过首先将糖乙酰化然后用HF/吡咬处理，可由游离糖制备氟代糖。 通过与于曱醇中的弱（催化性)碱(例如NaOMe/MeOH)反应，可以将乙酰 化的氟代糖脱保护。而且，多数氟代糖是商业上可得到的。其它活化的 糖基衍生物可应用本领域技术人员已知的常规方法制得。例如，曱磺酸 糖基酯可通过用甲磺酰氯处理完全千化半缩醛形式的糖，随后通过催化 氬化除去千基制得。

该反应进一步的成分为催化剂量的磷酸核苷或其类似物。本发明适 用的一磷酸核普包括例如一磷酸腺苷(AMP)、 一磷酸胞普(CMP)、 一磷 酸尿苷(UMP)、 一磷酸鸟苦(GMP)、 一磷酸肌苷(IMP)、和一磷酸胸苦 (TMP)。根据本发明所适用的三磷酸核苷包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸 胞苷(CTP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸肌苷(ITP)和 三磷酸胸苦(TTP)。优选的三磷酸核苷为UTP。优选地，磷酸核苷为二磷酸核苷，例如二磷酸腺苷(ADP)、二磷酸胞苷(CDP)、二磷酸尿苷(UDP)、 二磷酸鸟苷(GDP)、 二磷酸肌苷(IDP)和二磷酸胸苷(TDP)。优选的二磷 酸核苷为UDP。如上所述，也可用磷酸核苷的类似物实施本发明。适合 的类似物包括，例如核苷硫酸盐和磺酸盐。其它的类似物还包括简单的 磷酸盐，例如焦磷酸盐。

一种在例如鼠细胞(其中唾液酸的羟基化物形式占优势(NGNA))中 产生改性重组蛋白质的方法是用唾液酸酶处理蛋白质，除去NGNA-型唾 液酸，随后用试剂UDP-Gal和P -1,4-Gal转移酶进行酶的半乳糖基化， 产生高度同种的G2糖形。该制品然后可任选地用试剂CMP-NANA和 a-2,3-唾液酸转移酶处理，得到高度同种的G2S2糖形。

唾液酸变体的结构特征

至于含唾液酸变体寡糖的结构特征，将包括抗体制品的糖蛋白制品 用肽-N-糖苦酶F处理以释出N-连接的寡糖。酶肽-N-糖苷酶F(PNGase F) 可分开天冬酰胺连接的寡糖。将释出的寡糖用邻氨基苯甲酸(2-氨基苯甲 酸）标记荧光，通过所述的HPLC(参见Anumula, K. R.和Dhume ST Glycobiology. 1998 Jul;8(7):685-94)进行纯化和分析。如图3所示，寡糖 在色谱图中分离为可检测和定量的GO、 Gl、 G2、 G2S1和G2S2。糖基 化的种类-天然缺乏聚糖的或具有被化学或酶分解的聚糖被指定为Gno 。

唾液酸变体的生物学特征

通过几种众所周知的体外分析，可比较含有Fc蛋白质的功能性。 尤其感兴趣的是Fc y受体的Fc yRI、 FcyRII、和FcyRIII家族成员的 亲和性。应用受体的重组可溶形式或受体细力包相关的形式，可进4亍这些 测量。此外，例如通过BIAcore应用重组可溶的FcRn，可测量FcRn(负 责延长IgG循环半衰期的受体）的亲和性。基于细胞的功能测定诸如 ADCC测定和CDC测定，提供了洞察特定变体结构的功能结果的可能 性。在一个实施方案，ADCC测定中配置有NK细胞充当初级的效应细 胞，从而反映出对Fc yRIIIA受体的功能影响。也可应用吞噬作用试验 以比较不同变体的免疫效应子功能，因为实验可测量细胞应答诸如过氧 化物或炎症介质的释放。亲和力和亲合力的测定可测试天然多价抗体以确定其与靶蛋白质结合的多种参数。测定表观Kd方便的形式为ELISA(酶联免疫吸附测定）或RIA(放射性免疫测 定）。"ELISA"通常被用于表示在固体载体上应用间接测定方法所进行的 结合测定。 一般地，在ELISA中，在与固相反应物特异性结合后，将可 溶性分析物从溶液中分离。在这种方法中，通过在塑料微孔板上吸附抗 原或抗体制得固相反应物；在其它方法中，固相反应物为细胞相关的分 子。在所有的方案中，将固相反应物与酶共价偶联的第二或第三反应物 一起孵育。通过清洗除去非结合的偶联物，并加入发色或荧光 (fluorogenic)的底物。由于底物被结合的酶偶联物所水解，产生了有色的 或荧光的产物。最后，在视觉上或用微孔板读数器检测产物。所产生的 信号强度与试验混合物中最初分析物的量成比例。

在固相测定的变体中，可间接地固定或俘获抗原，例如应用可识别 抗原无关结构域的固定俘获的抗体，或通过应用抗体或其它的配体，其 与靶蛋白质(例如多组氨酸序列）中设计的"tag"结合。

测量表面抗原抗体结合的替代选择性方法是应用整体细胞，其在细 胞表面表达(天然地或通过基因工程)抗原。将这些细胞与含初始抗体的 试验溶液一起孵育。将非结合的抗体洗掉，然后将细胞与酶偶联物一起 孵育，以获得初始抗体的特异性抗体。将非结合的酶偶联物洗掉，然后 加入底物溶液。结合初始抗体的水平与底物水解的量成比例。如果每单 位体积的细胞数保持不变，则可定量。替代选择地，通过如上所述的直 接结合或竟争，应用放射标记配体进行测定。ELISA测定的方案参见于 例^口 In: Ausebel, FM等.Cw/re"f尸n7toco/s & Mo/ecw/ar Szo/ogy. 2003 John Wiley & Sons, Inc。

应用固相结合剂或配体以及流动液相结合剂或配体的BIAcore技 术，通过表面等离子体共振法检测，可测量结合速率、締合速率和离解 速率。

f#潔好才法

由于抗体糖基化在清除率中的作用，因此含有治疗性Fc蛋白质的 药动学似乎是最小限度的（mimmal);与新生的Fc受体(FcRn)的结合被认 为是负责从循环中除去IgG,似乎不受抗体Fc部分上缺乏N-连接寡糖的干扰。

连接IgG抗体介导的免疫应答与细胞效应子功能的IgG Fc受体(FcR) 包括Fcy受体:FcRI (CD64)、 FcRII(CD32)(FcRIIA和FCRIIB两种）、和 FcRIII (CD16)。所有三者均发现在单核细胞上显示。然而，在各种靶细 胞上这些受体的精细之处似乎出现差异并与其它因素对应。因此，含糖 基化修饰Fc的生物治疗药物对Fc Y受体的亲和性测量是适用于预测提 高效应子功能的测量。

据报道，在其Fc聚糖上含低水平岩藻糖的人IgGl Ab对人CD 16 FcR具有更大的亲和性，且在应用人PBMC效应细胞的ADCC测定中显 著地提高体外活性(Shinkawa等.J Biol Chem 278(5):3466画3473, 2003; Shields等.J Biol Chem 277(30):26733-26740， 2002; Umana等.，Nat Biotech 17:176-180,1999)。

应用体外ADCC测定，可以定量的方式进行效应子功能的评价方 法。因此，体外测定可以设计为测量结合抗体引起细胞破坏的能力，其 中通过正确选拷4巴和效应细胞系显示其近亲配体和通过使细l包无力继 续分化或通过内容物的释放例如"Cr释放评价细胞"杀死"。粑细胞可以 是对本发明的抗体、抗体片段、或融合蛋白正常表达靶配体的细胞系， 或可以是设计为在其表面表达和保留靶蛋白质的细胞系。这样设计的细 胞系实例为K2细胞、Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系，在其表面可稳定表达由 于导入删除1-12位氨基酸的成熟细胞因子而保持跨膜形式的重组人 TNF(Perez等.，Cell 63 :251 -258, 1990)。这种细胞系可用于评价抗TNF 抗体、抗体片段、或设计具有Fc区域或Fc区域活性的抗TNFoc耙融 合蛋白在ADCC活性中的变化。

用于体外ADCC活性测定的效应细月包可以是人或其它哺乳动物来 源的PBMC(外周血单核细胞）。可以通过一皮认可的方法将PBMC效应细 胞从收集的供体血液中新鲜分离出。其它可以应用的单核细胞或巨噬细 胞为流出液体如腹膜渗出液所衍生的那些细胞。

用于测量细胞免疫功能的体内模型也是可用的。例如，抗CD3抗体 可用于小鼠内测量T细胞活化，因为T细胞活化依赖于抗体Fc域衔接 特异性FcY抗体的方式。体外，比较了抗CC趋化因子受体4的嵌合体 人IgGl Ab的高岩藻糖和低岩藻糖型式(version)的抗胂瘤活性，没有观 察到它们在体外ADCC活性中的差异(应用小鼠效应细胞），然而，低岩藻糖Ab在体内显示更强的效能。提供了非人的效应细胞且小鼠保留内源的NK细胞(N雇等.Cancer Res 64:2127-2133, 2004)。因为已证明人 NK细胞上的CD16受体对IgGl Ab的岩藻糖水平有提高的敏感性，这些 数据提示小鼠中起作用的机制不同于人效应细胞中所研究的机制。 一种 可能性为更近发现的小鼠CD 16-2受体（Mechetma等.Immunogen 54:463-468,2002)。与众所周知的小鼠CD 16受体相比，小鼠CD 16-2 的胞外域具有显著更高的与人CD 16A相同的序列（65%),提示它对其结 合的IgG的岩藻糖水平可能比小鼠CD 16更敏感。据报道鼠巨噬细胞样 J774细胞中的表达与Niwa等.(2004)所述的表达CD 16-2的鼠巨噬细胞 可导致低岩藻糖Ab有更大抗肿瘤活性的可能性一致。因此，含人IgGl-型Fc的蛋白质结合Fc受体对鼠效应细胞的研究是不可预言的。

蛋白质生产方法

生产含有Fc蛋白质所涉及的不同方法可影响包括唾液酸的Fc寡糖 的结构。在一个实施方案中，在先前没有受到升热处理(例如56°C, 30 分钟)的血清例如胎牛血清(FBS)存在下，培养分泌含有Fc蛋白质的宿主 细胞。这可产生含有Fc的蛋白质，它不含或含有非常低量的唾液酸， 这是由于血清中天然存在活性唾液酸酶，它可从这些细胞所分泌的含有 Fc的蛋白质上除去唾液酸。在另一个实施方案中，在受到升热处理因此 使唾液酸酶灭活的血清存在下，或者在没有包含唾液酸酶的血清或其它 培养成份下，培养分泌含有Fc蛋白质的细胞，致使含有Fc蛋白质具有 更高水平的唾液酸，对于应用（例如,治疗学适应症）来说这是令人想要的。

在另一个实施方案中，建立了用于纯化和进一步处理含有Fc蛋白 质的条件，可利于优化唾液酸含量。例如，因为唾液酸为酸不稳定的， 延长暴露给低pH环境，例如随着从A蛋白层析柱上洗脱或滤过性毒菌 灭活过程期间，可同时导致唾液酸含量减少。

宿主细胞的细胞工程学

如本文所述，用于表达含重组Fc蛋白质或单克隆抗体所选择的宿 主细胞对促成最终组成（包括没有限于在免疫球蛋白CH2域修饰蛋白质 的寡糖部分组成的变体)是重要的。因此，本发明的一个方面涉及选择适当的宿主细胞，用于表达预期治疗蛋白质的细胞生产的用途和/或开发。 在一个实施方案中，宿主细胞为天然缺损或缺乏唾液酸转移酶的细 胞。在另一个实施方案中，宿主细胞为遗传上修改或处理过的没有唾液 酸转移酶的细胞。在进一步的实施方案中，宿主细胞为经选择衍生的宿 主细胞系，其表达减少的或不能检测到的唾液酸转移酶的水平。在又一 个实施方案中，宿主细胞为天然缺乏的或为遗传上修改或处理过的没有CMP唾液酸合成酶的细i包，所述酶催化形成CMP唾液酸，其又为唾液 酸转移酶用于转移唾液酸至抗体的唾液酸来源。在相关的实施方案中， 宿主细胞可为天然缺乏的或为遗传上修改或处理过的没有丙酮酸合成 酶的细月包，所述酶/人丙酮酸形成唾液酸。

在另外的实施方案中，宿主细胞可为天然缺乏的或为遗传上修改或 处理过的没有半乳糖基转移酶的细胞，致使所述细胞中表达的抗体缺乏 半乳糖。没有半乳糖，唾液酸就不能连接。在单独的实施方案中，宿主 细胞细胞可为天然过表达的或遗传上修改为过表达的细胞，在生产期间 唾液酸酶/人抗体上除去唾液酸。这样的唾液酸酶可在抗体分泌或分泌至 培养基前在细胞内作用于抗体，且作用于已经分泌至培养基中的抗体。 选择改变了转葡糖基酶的细胞系及其表达改变碳水化合物成分的糖蛋 白方法已经有描述（Ripka和Stanley, 1986. Somatic Cell Mol Gen 12:51-62; US2004/0132140)。工程化宿主细力包生产具有改变糖基化型且 导致ADCC提高的抗体的方法，已有教导，例如美国专利6,602,864, 其中宿主细胞包含核酸,所述编码核酸至少 一个糖蛋白改性的糖基转移 酶，尤其为P (1,4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶(acetyl glucosamnyltranferase) III (GnTIII)。

如EP1,176,195所教导，通过操作宿主细胞糖基转移酶对宿主细胞 糖基性质的基因工程的其它方法包括消除或抑制其活性，特别地oc -1,6 岩藻糖基转移酶(FUT8基因产物）。实践除上述具体实施例外的宿主细胞 工程学的方法，对本领域技术人员来说应是显而易见的。进一步地，工 程化宿主细胞可以为哺乳动物源细胞或可以选自骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、 昆虫或植物细胞、或它们的任何衍生细胞、永生化细胞或变异细胞。

在另一个实施方案中，抑制或消除唾液酸连接所需酶的活性的方法 可以选自基因沉默诸如通过应用siRNA、基因敲除、或加入酶抑制剂， 诸如通过酶特异性结合和阻滞其酶活性的细^>内Ab或肽的共同表达，和其它已知的基因工程技术。在另一个实施方案中，阻滞唾液酸连接的酶 或除去已连接唾液酸的唾液酸酶的表达或活性的提高方法，可以选自重组体酶基因转染、提高酶RNA合成的转录因子的转染、或提高酶RN A 稳定性的基因修饰，所有这些导致提高的酶诸如唾液酸酶的活性,致使纯 化产物中唾液酸水平更低。在另一个实施方案中，可以向细胞培养基中 加入特异酶抑制剂。

抗体

本申请所述的抗体可包括或为任何哺乳动物书f生的，例如^f旦不限于 人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物或它们的任何组合，且 包括分离的人、灵长类动物、啮齿类动物、哺乳动物、嵌合体的、人源 化的和/或CDR嫁接的抗整联蛋白抗体、免疫球蛋白、分解产物和其它 特定的部分和其变体。本发明也涉及抗体，编码或补充核酸、载体、宿 主细胞、组成、制品、装置、转基因动物、转基因植物、和制备和应用 它们的方法，如本文所述与本领域已知的共同组合在一起。

本发明进一步提供细胞、细胞系、和细胞培养物，其表达免疫球蛋 白或其片断，能使CH2域糖基化，所述CH2域结合抗原、细胞因子、 整联蛋白、抗体、生长因子、细胞语系和分化的标示物的表面抗原、激 素、受体或其融合蛋白、血液蛋白质、涉及凝固的蛋白质、其任何片断、 和任何前述的任何结构或功能类似物。在优选的实施方案中，免疫球蛋 白、片断或其衍生物在靶细胞表面结合抗原。在尤其优选的实施方案中， 輩巴细胞为肿瘤细胞、肿瘤脉管系统细胞、或免疫细胞。在具体实施方案 中，免疫球蛋白、片断或其衍生物结合TNF、整联蛋白、B细胞抗原、 或组织因子。

在又一个实施方案中，本发明的细胞、细胞系、和细胞培养物可检 测地表达包含生长因子和激素的融合蛋白。本发明期望的生长因子的实 例包括但不限于人生长因子、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、 成纤维细胞生长因子、神经生长因子、人绒毛膜促性腺素、促红细胞生 成素（erythropoeitm)、血小板生成素、成骨蛋白质、转化生长因子、胰 岛素样生长因子、或胰高血糖素样肽、和它们的任何结构或功能的类似 物。

本发明的分离抗体包括具有ADCC活性的抗体同型，尤其为人IgGl(例如，IgGl k和IgG入）,和更少优选的IgG2和IgG3，或在Fc域特异 残基上含有改变残基的杂种同型为它们的其它物种相似物的那些抗体。 抗体可为全长的抗体（例如，IgGl)或可为仅仅包括能够引出效应子功能 (包括ADCC、补体激活和Clq结合)的抗原结合部分和Fc部分或区域。

此外，本发明的细胞、细胞系、和细月包培养物所产生的免疫球蛋白 片断可包括但不限于包含Fc或其它CH2区域的结构及其任何结构或功 能类似物。在一个实施方案中，免疫球蛋白片断为二聚体受体域的融合 多肽。在特定的实施方案中，二聚体受体域的融^多肽为依那西普 (etanercept)。依那西普为重组可溶的TNFa受体分子，皮下地给药后与 患者血清中的TNFot结合，使之在生物学上失去活性。依那西普为二聚 体融合蛋白，由与人IgGl的Fc部分连接的人75千道尔顿(p75)肿瘤坏 死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分组成。依那西普的Fc成分包 含CH2域、CH3域和铰链区，但不含IgGl的CH1域。

应用本发明细胞系易于制备的其它产物包括目前由其它类型的动 物细胞系所制备的具有能够被糖基化的CH2的治疗或预防性蛋白质。特 别优选的为治疗的、糖基化的、含CH2区域的与细胞表面的靶抗原结合 的蛋白质，其细胞类型预期可由体内失能或消除。许多这样的治疗性抗 体被设计为包含人IgGl，尤其包含人CH1、 CH2和CH3域的IgGl重链。

英利昔单抗(Infliximab),目前以REMICADE⑧销售。英利昔单抗为 嵌合体的IgGlK单克隆抗体，具有大约149,100道尔顿的分子量。它包 含人恒定区和鼠可变区。英利昔单抗特异性结合人肿瘤坏死因子oc (TNF(oc)),其结合常数为101GM-1。英利昔单抗通过高亲和性结合可溶 性和跨膜形式的TNF(oc)并抑制TNF(a)与其受体的结合，中和TNF(a) 的生物活性。表达与英利昔单抗结合的跨膜TNF(cx)的细胞可在体外或 体内溶解。英利昔单抗适用于治疗风湿性关节炎、克罗恩氏病和僵直 性(alkylosing)脊推炎。英利昔单抗以静脉输注给予3至5 mg/kg的剂量 给药，随后根据要治疗的疾病在第2、 6和/或8周且以每8周的间期给 予另外的类似剂量。

达克珠单抗（以ZENAPAX⑧销售）为通过重组DNA技术产生的免疫 抑制的、人源化的IgGl单克隆抗体，它与活化淋巴细胞表面表达的人高 亲和性白细胞介素2(IL-2)受体的cc亚单位(p55 cx 、 CD25、或Tac亚单位）特异性结合。达克珠单抗为互补决定区(CDR)嫁接的d、鼠-人嵌合抗体。

人序列来自人IgGl恒定域和Eu骨髓瘤抗体的可变构架区。鼠序列来自 鼠抗Tac抗体的CDR。达克珠单抗适用于预防接受肾移植患者的急性器 官排斥并通常用作免疫抑制方案（包括环孢菌素和皮质甾类）的一部分。

巴利昔单抗（以SIMULECT⑧销售）为通过重组DNA技术产生的嵌合 (鼠/人)单克隆抗体，其充当免疫抑制剂，特异性结合并阻滞于活化T淋 巴细胞表面上的白细胞介素2受体（oc)-链(IL-2R(oc),也称作CD25抗 原）。基于氨基酸序列，蛋白质的计算分子量为144千道尔顿。它为糖蛋 白，获自遗传工程所建立的小鼠骨髓瘤细胞系的发酵，以表达编码选择 性结合IL-2R(a)的RFT5抗体的包含人重和轻链恒定区基因（IgGl)和鼠 重和轻链可变区基因的质粒。巴利昔单抗适用于预防接受肾移植患者的 急性器官排斥，用作免疫抑制方案（包括环孢菌素和皮质甾类）的一部分。

阿达木单抗（以HUMIRA?销售）为人肿瘤坏死因子(TNF)特异的重 组体人IgGl单克隆抗体。应用噬菌体展示技术制造阿达木单抗，导致抗 体具有人衍生的重和轻链可变区和人IgGl k恒定区。HUMIRA⑧适用于 对一和多种DMARD不充分反应的具有中等至严重的活动风湿性关节 炎的成年患者，以减少体征和症状以及抑制结构'性损伤的进行。 HUMIRA⑧可单独或与MTX或其它的DMARD结合应用。

利妥昔单抗（以RITUXAN⑧销售）为遗传工程嵌合的鼠/人单克隆抗 体，直接对抗正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原。抗体为 IgGl k免疫球蛋白，包含鼠轻和重链可变区序列和人恒定区序列。利妥 昔单抗对CD20抗原的结合亲和力大约为8.0nM。利妥昔单抗适用于治 疗低级别或滤泡的、CD20 P日性、B细胞非何杰金淋巴瘤的复发或难治 性患者。RITUXAN?以375 mg/m 2 IV输注给药，每周一次应用4或8 次剂量。

曲妥珠单抗（以HERCEPTIN⑧销售）为重组DNA衍生的人源化单克 隆抗体，其在基于细胞测定(Kd二5nM)中对人表皮生长因子受体2蛋白质 HER2的胞外域具有高亲和力的选择性结合。该抗体为IgG 1 k,包含 人构架区，具有与HER2结合的鼠抗体（4D5)的互补决定区。 HERCEPTIN(赫赛汀）可适用于单种药物治疗法，用于治疗转移乳l^癌 (这种肿瘤过度表达HER2蛋白质)且对其转移性疾病已接受一种或多种 化学疗法方案的患者。HERCEPTIN⑧与紫杉醇组合适用于治疗转移乳腺癌（这种肿瘤过度表达HER2蛋白质）和对其转移性疾病没有接受化学疗 法方案的患者。推荐剂量为90分钟输注给予起始负荷剂量的4 mg/kg 曲妥珠单抗，如果起始负荷剂量耐受良好可30分钟输注给予每周维持 剂量的2 mg/kg曲妥珠单抗。

阿仑珠单抗（以CAMPATH⑧销售）为重组DNA衍生的人源化单克隆 抗体(Campath-lH)，直接对抗21-28 kD细胞表面糖蛋白CD52。阿仑珠 单抗结合CD52,为非调节的抗原，位于基本上所有B和T淋巴细胞， 大部分单核细胞，巨嗟细胞和NK细胞，粒细胞亚群，和雄性生殖系统 组织的表面。Campath-1H抗体为IgGlK ,具有人可变构架区和恒定区， 和鼠（大鼠)单克隆抗体(Campath-lG)的互补决定区。Campath适用于治疗 B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的患者，该患者已经用烷化剂治疗且 经历氟达拉滨治疗失败。Campath效果测定是基于整体响应率。最初给 予3 mg的Campath,每日2小时内IV输注给药；一旦耐受,此每日剂量 应升至10mg并连续给药直至耐受。 一旦耐受了这种剂量水平，可开始 以30mgCampath的维持剂量，每周三次给药，最高可给予12周。在大 多数患者，升至30mg可在3-7天内实现。

奥马珠单抗（以XOLAIR⑧销售）为重组体人源化的IgGl( k )单克隆抗 体，其与人免疫球蛋白E(IgE)选择性结合。奥马珠单抗抑制IgE与肥大 细胞和嗜碱细胞表面上的高亲和性IgE受体(Fc(s)RI)的结合。在携带 (Fc(s)RI)细胞上表面结合IgE的减少限制了变应性应答介质的释放程 度。用奥马珠单抗治疗也减少了特应性患者嗜碱细胞上Fc( s )RI受体的 数目。奥马珠单抗适用于中等至严重持续哮喘的成人和青少年(12岁和症状为吸入皮;甾类;能充;控制的。以15〉0」375^mg的剂量每2或: 周SC给予奥马珠单抗。

依法珠单抗(RAPTIV A?)为与人CD11 a结合的免疫抑制的重组人源 化的IgGl k同型单克隆抗体。依法珠单抗结合所有白细胞上表达的 CD11 a(白细胞功能抗原-1 (LFA-1)的（a )亚单位）,并减少细胞表面CDlla 的表达。依法珠单抗抑制LFA-1与胞间粘附分子-l(ICAM-l)的结合，因 而抑制白细月包与其它类型细^9包的粘附。LFA-1和ICAM-1之间的相互作 用促成多种进程的开始和维持，所述进程包括T淋巴细胞激活、T淋巴 细胞与内皮细胞的粘附、和T淋巴细胞迁移至炎症包括牛皮痺皮肤的位置。淋巴细胞活化和运输至皮肤在慢性斑块状银屑病的病理生理学中担 任作用。牛皮裤皮肤中，ICAM-1细胞表面的表达在内皮和角化细胞是向上调节的。CDlla也在B淋巴细胞、单核细胞、中性白细胞、天然杀 伤细胞和其它白细胞的表面上表达。因此，依法珠单抗对激活、粘附、 迁移和除了 T淋巴细胞的细胞数目存在潜在性影响。RAPTIVA⑧的推荐 剂量为单独0.7 mg/kg SC调节剂量(conditioning dose),随后1 mg/kg的 每周SC剂量(最大单次剂量总数不超过200 mg)。

在另 一 个实施方案中,本发明的细胞系是稳定转染的或另外工程化 表达非免疫球蛋白衍生的多肽的细胞系，但是所述多肽落在含有Fc蛋 白质定义内。

本发明编码核酸的抗体和蛋白质可用本领域众所周知的几种方法 获得。在一个方面，通过用本发明肽免疫小鼠制备的杂交瘤可方便地获 得抗体。抗体因此能得自所用的本领域众所周知的任何杂交瘤技术，参见i"列^t口，Ausubel,等纟扁4辱，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook,等.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow和Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989》Colligan,等编辑，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY G"4-2001); Colligan等.，Current Protocols in Protem Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001),在此将各自的全文引 入，作为参考。

在抗体的靼结合部分（一般为抗体的可变重和/或可变轻区域)衍生 的另一个适宜方法中，这些部分选自已建立的结合区域文库，例如噬菌 体文库。通过插入包含感兴趣序列的任意寡核苷酸文库或多聚核苷酸文 库，例如来自免疫动物或人的B细胞,可建立噬菌体文库（Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317)。抗体噬菌体文库在一个噬菌体中包含重 (H)和轻(L)链可变区对，可表达单链Fv片断或Fab片断(Hoogenboom,等. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8)。可利用噬菌粒文库的多样性以增加 和/或改变文库单克隆抗体的免疫特异性，以生产另外预期的人单克隆抗 体并随之鉴定。例如可将编码重(H)链和轻(L)链的免疫球蛋白分子的基 因随机地混合(混洗)以在装配的免疫球蛋白分子中建立新的HL对。

此外，可在免疫球蛋白多肽可变区的互补性决定区（CDR)将编码H和L链的两者或之一的基因诱变处理，随后篩选预期的亲和力及中和能 力。通过选择一或多个人构架序列并引入人抗体谱衍生或变体设计的CDR盒(cassette)集合，也可合成地建立抗体文库(Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602)。多样性的位 置不限于CDR,也可包括可变区的构架区段或可包括与抗体不同的可变 区，例如肽类。

可包括与抗体不同的可变区的耙结合成分的其它文库为核糖体展 示、酵母展示、和细菌展示。核糖体展示为在保持蛋白质与RNA连接 时将mRNA翻i,成同源蛋白质的方法。编码核酸的序列通过RT-PCR恢 复(Mattheakis, L.C.等.1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,卯22)。酵母 展示基于膜相关的oc凝集素酵母粘着受体(agal和aga2,交配型系统的 一部分）的融合蛋白构建（Broder,等.1997. Nature Biotechnology, 15:553-7)。细菌展示为基于与细胞膜或细胞壁相关的输出细菌蛋白质的 革巴向鬲虫合(Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503)。

与杂交瘤技术学比较，噬菌体和其它抗体展示的方法提供了体外抗 抗原靶的选择性操作的机会，且不受到宿主对抗原可能影响的限制，或 者反之亦然。

宿主细月包

本文所述的宿主细胞包括能够产生特异性抗体宿主细胞，所述抗体 的寡糖容量中具有确定的唾液酸含量。

不像大多数从连续基因组DNA序列转录的基因，抗体基因是由种 系中广泛分离的基因节段所装配的。特别地，通过重组编码抗体可变 (V)、多变(D)和连接(J)/恒定(C)区的三个基因组段，形成重链基因。通 过连接两个基因节段，其中一个编码V区和另一个编码J/C区，形成功 能轻链基因。重链和k轻链基因座均含有多个V基因片段(估计在100 ~ 1000之间变化），估计充分扩展可达1000 kb。作为对比，入基因座是非 常小的，已经显示在小鼠染色体16上伸展大约为300 kb。它由两个可 变基因区段和四个连接/恒定(J/C)区基因段组成。功能基因的形成要求V 和J/C成分之间重组。

在天然产生抗体的B细胞中，对重和k轻链基因两者重排的转录控 制依赖于V区上游组织特异性启动子的活性和位于J-C内含子的组织特异性增强子的活性。这些成分协同地作用。并且，在K轻链基因座中已 经鉴定了第二种B细胞特异性增强子。这种另外的增强子位于Ck的下游9kb处。因此，使永生抗体表达基因的杂交瘤方法依赖于母体B细胞 谱系的内源启动子和增强子序列。替代选择地，在包含编码内源DNA 的本发明抗体的内源宿主细胞中通过启动（通过操作），可以在宿主细胞 中表达本发明的核酸。这样的方法是本领域众所周知的，例如美国专利 号5,580,734、 5,641,670、 5,733,746、和5,733,761中所述的，在此将这 些专利全文引入，作为参考。

将抗体基因组DNA克隆至人工载体为建立能够表达抗体的宿主细 胞的另一种方法。然而，强启动子后单克隆抗体的表达增加了鉴别高产 细胞系和获得高产率单克隆抗体的机会。应用例如本领域众所周知的重 组DNA技术和基因转染的组合方法，可在宿主细胞转染瘤中生产本发 明的抗体(例如，Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。

在多种不同宿主细胞中的克隆和多肽表达系统是众所周知的。适用 的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母和杆状病毒系统 以及转基因植物和动物。本领域中可用的表达完整异种多肽糖基化蛋白 的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa纟田胞、仓鼠婴肾 细胞(BHK)、 NSO小鼠黑色素瘤细l包和衍生的细胞系（例如SP2/0、 YB2/0(ATC CRL-1662)大鼠骨髓瘤细胞)、人胚肾细胞(HEK)、人胚视网 膜细胞PerC.6细胞、hep G2细胞BSC-l(例如ATCC CRL-26)和可用的 许多其它细月包系，例如来自美国标准培养收集所Manassas, Va (www.atcc.org)的细l包系。通常优选的细菌宿主为大肠杆菌（E. coli)。

哺乳动物细胞例如CHO细胞、骨髓瘤细胞、HEK293细胞、BHK 细胞(BHK21、 ATCCCRL-IO)、小鼠Ltk细胞、和NIH3T3细胞，已常 用于异源基因的稳定表达。细胞系如Cos(COS-l ATCC CRL 1650; COS-7: ATCC CRL-1651)和HEK293是常规用于重组蛋白质瞬时表达的。

用于表达本发明重组抗体优选的哺乳动物宿主细胞包括骨髓瘤细 月包例如Sp2/0、 YB2/0(ATC CRL-1662)、 NSO、和P3X63.Ag8.653(例如 SP2/0-Agl4),这是因为它们的高速表达。特别地，至于应用NSO骨髓 瘤细胞，另一个优选的表达系统为WO 87/04462、 WO 89/01036、和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体 引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够的时期以使抗体在宿主细胞中表达来生产抗体，更优选地，抗体分泌至宿主细胞生长的培 养基中。应用标准的蛋白质纯化方法，可从培养基中回收抗体。

CH0-K1和DHFR-CHO细胞DG44和DUK-Bll(G. Urlaub, L. A. Chasm, 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77， 4216匿4220)被用于高水平 的蛋白质生产，因为通过应用例如药物曱氨喋呤(MTX)掺入可选择的扩 增的标记DHFR，能够进行感兴趣的基因扩增（RJ. Kaufman, 1990. Methods Enzymol. 185:537-566)。 DHFRXHO细胞可成功地用于高水平 生产重组体mAb。 DHFR-CHO可以以80-110 mg 106细胞"天-1的速度或 大于200 mg 106纟田胞"天"的速度产生抗MCP-1抗体。已用多种启动子 以获得在这些CHO细胞中H-和L-链的表达，例如b-肌动蛋白启动子、 人CMVMIE启动子、腺病毒(Ad virus)主要晚期启动子(MLP)、 RSV启 动子、和鼠白血病病毒LTR。在文献中描述了许多表达mAb的载体， 其中两个Ig链被两个不同的具有独立可选择/扩增标记的质粒携带。载 体含有一个抗体链例如与DHFR标记连接H-链，且与Ne(/标记连接L-链表达盒或者反过来也一样，此载体在旋转烧瓶中可用于获得高达180 mg的人源化mAb L"7天人用于起始选择和随后扩增的方法可以是各 式各样的且是本领域技术人员众所周知的。 一般而言，应用下述步骤可 获得高水平的mAb表达:起始选择和随后扩增的候选的克隆，共选择(例 如在H-链和L-链两种表达载体携带DHFR表达单位的情形中）和扩增， 应用不同扩增标记的共扩增，和起始选择和随后扩增的大量培养，随后 通过稀释克隆法鉴定各个高表达的克隆。因为整合位点可以影响H-链和 L-链表达和全部mAb表达的效率，已建立了其中两个Ig-链表达单位串 联在一起的单载体。这些载体也携带显性可选标记诸如Ne(/和DHFR 表达盒。至于综述参见Ganguly, S.和A. Shatzman. Expression Systems, mammalian cells IN: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation: Biocatalysis, and Bioseparation. 1999， John Wiley & Sons,Inc.。

Cockett等（1990. Bio/Technology 8, 662-667)开发了在CHO细胞中 高水平表达异源基因的GS系统。将包含cDNA(在hCMV启动子的转录 控制下）和GS小基因（在SV40后期启动子控制下）的表达载体转染至 CHO-K1细月包(用20 mM ~ 500 mM MSX选择后），可用于产生表达本发 明抗体的克隆，其产率比得上DHFR-CHO系统中的产率。结合欧洲专 利号0 216 846、 0256 055、和0 323 997和欧洲专利申"i青号89303964.4,整体或部分地讨论了 GS系统。

当以一般术语描述本发明后，在下列实施例中进一步公开了本发明 的实施方案。

实施例l:唾液酸不同水平的抗体种类基于凝集素的分离

与MAA(怀槐凝集素)或WGA(麦胚凝集素)偶联的琼脂糖小球购自 Vector Labs或EY Labs。测试抗体Abl为完全人类单克隆抗体,可结合人 TNF。将于含20 mM CaCl2和20 mM MgCl2的20 mM Tris-HCl緩冲剂 (pH 7.0)中的Abl(~ 1-10 mg),在MAA-琼脂糖或WGA-琼脂糖柱上分级 分离。与MAA-琼脂糖柱结合的Abl用0.5%乙酸洗脱，用1M Tris-HCl (pH7.0)中和，然后将緩冲剂换为PBS。这种物质称作Abl MAAB。

在将Abl抗体样品装载至WGA-琼脂糖柱后，收集非结合(T,经过） 部分，并将緩冲剂换为PBS。这种物质称作Abl WGAT。如上所述用相 同的緩冲剂清洗含结合Abl的柱，当在280 nm测量OD监测时，收集 lml部分的任何洗脱的抗体(代表弱结合(R,延滞)物质）。将洗脱的物质的 緩沖剂换为PBS，称作Abl WGA-R。最后，洗过后还与柱结合的物质 用200 mM GlcNAc溶液洗脱，并将样品緩沖剂换为PBS。这种物质称 作Abl WGAB。 HPLC和质谱法分析显示各子批的Abl实际上改变了其 唾液酸的含量(参见表1),范围从Abl MAAB的高43%至Abl WGAT 的低29%。将另 一批未改性的Ab 1-29直接经过固定的麦胚凝集素(WGA) 凝集素。测定流过的部分和弱结合部分，分别含有29%和41%唾液酸化 聚糖，并称作Abl-WGA-29和Abl-WGA-41。

另 一个抗TNF Ab为Ab2,其含有大约5%Fc唾液酸化，在WGA柱 分级分离前首先用半乳糖基转移酶处理以制备完全半乳糖基化的物质， 形成大量的Ab2-GT-WGA-5和少量的Ab2-GT-WGA-67。 Ab2识别的抗 原与Abl识别的抗原相同，Ab2识别的抗个体基因型（抗Id)抗体称作抗 Id2。

实施例2:半乳糖基化和唾液酸化抗体的酶修饰

为经酶方法使纯化的抗体样品半乳糖基化，向抗体样品中加入来自 Sigma Chemical Co.(St. Loms, MO)的牛P -1,4陽半乳糖基转移酶（(3 1,4GT) 和UDP-Gal。重组体大鼠肝oc画2,3-唾液酸转移酶（oc 2,3ST)、重组体cc陽1,3陽-Sia来自Calbiochem (San Diego, CA)。 PNGase F来自New England Biolabs (Beverly, MA)或来自Prozyme (San Leandro, CA)或来自Selectin Biosciences (Pleasant Hill, CA)。 （3 -半 乳糖苷酶和肺炎双球菌（Z^/?/ococc^ ;?wewwomae)的p-氨基葡糖苷酶获 自ProZyme或Selectm BioSciences。牛肾的P -半乳糖苷酶和所有其它的 酶获自ProZyme或获自Selectin Biosciences。 NAP-5和HiTrap蛋白A 柱获自Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)。所有其它的试剂为分析等级。

制备Abl的酶去糖基化形式(称作Gno),作为缺乏Fc免疫效应子功 能的对照抗体。这种变体的制备方法，包括取于100 mMMES緩冲液(pH 7.0)中的Abl(~ 10 mg ,1.0 mL緩冲液中）并用1000 U PNGase F在37°C 处理24小时。加入另一等分部分的酶并再继续孵育24小时。将去糖基 化Abl用HiTrap蛋白A柱纯化，并用pH 7.0 PBS配制。通过 MALDI-TOF-MS赋予Gno糖形的特征，以证实去糖基化。

除实验室所操作的Ab制品之外，也比较了唾液酸含量天然不同的 Ab子批，此处是指'天然变体'。将从初始批物质的緩沖剂换为PBS后， 未改性的抗体称作Abl PBS。人IgGl单克隆Ab, Abl和Ab3，其中此 对成员的唾液酸化程度不同，显然是由于用于制备它们的不同产生过程 (但是用同样的宿主细胞型生产）。Abl变体,Abl-20和Ab 1-29,分别含有 20%和29。/。唾液酸化聚糖；Ab5变体,Ab5-20和Ab5-26,分别含有0%和 26%唾液酸化聚糖。另外，每对成员具有同样的氨基酸序列、同样水平 的Fc岩藻糖基化和二等分GlcNAc含量(MALDI-TOF质谱法分析）、和 同样低水平的Ab聚集物(通过SEC-HPLC分析<1%)。

表1中概述了用于各种生物测定的Ab和含有Fc的蛋白质制品及衍 生它们的方式。

32表1.本文所用测试的含有Fc蛋白质制品的总目录

母体 特异变体 %唾液酸化 说明

抗体

AM — 一 抗TNF人IgGl抗体

Abl未改性的， 29 初始组成,天然唾液酸变体

Abl-29

Abl Gno N.A. 酶去糖基化的

AblPBS 29 未改性的，緩冲剂交换成PBS

Abl-20 20 天然唾液酸变体

AblMAAB 43 与MAA凝集素柱结合

AblWGAB 32 与WGA凝集素柱结合

AblWGAR 40 -波WGA省是集素柱延滞的

AblWGAT 29 经过WGA凝集素柱的

Abl画WGAR画41 41 被WGA凝集素柱延滞的

Abl陽WGAT-29 29 经过WGA凝集素柱的

Abl G2 0 酶改性成完全半乳糖基化

Abl G2S2(hi) 95 酶改性成G2S2

Abl G2S2(b) 33 失去大多数唾液酸的G2S2

Ab2 - — 抗TNF人IgGl抗体

未改性的Ab2 5% 未改性的,用于Fc y ri结合，图6

Ab2 G2 0% 改性的,用于小鼠PK研究，图8

Ab2 G2S2 ~ 90 % 改性的,用于小鼠PK研究，图8

Ab2 AlaAla 不相关的 对FcyR缺乏亲和性的突变型抗 TNF

Ab2 GT-WGAT 5 经过WGA凑是集素柱的

Ab2 GT-WGAR 67 半享L糖基化且与WGA凝集素柱结合

Ab3 - 一 对细胞因子亚单位的特异

Ab3(lo) 2 天然唾液酸变体

Ab3(hi) 42 天然唾液酸变体

Ab4 Ab4 — 小鼠IgGl(对Fc y RI缺乏亲和性）

Ab5 Ab5 结合异二聚体细胞表面受体

33<table>table see original document page 34</column></row> <table>所有测试样品包含人IgGl铰链、CH2、和CH3域。Abl、 Ab2、 Ab3、和Ab5为单克隆IgG Ab,具有人IgGl和k恒定区。Abl为对人 TNF特异的完全人Ab, Ab2为对人TNF特异的鼠/人嵌合体Ab。 Ab3 为对异二聚体促炎细胞因子的亚单位之一特异性的完全人Ab。所有四 个Ab均在转染Sp2/0的小鼠骨髓瘤细胞中表达。Ab5为直接对抗异二 聚体细胞表面受体亚单位的全人抗体。FcPl为二聚体融合蛋白，其包含 人的人IgGl铰链、CH2和CH3域。

G2糖形的制备方法，包括在37。C使于100 mM MES緩冲液(pH 7.0) 中的IgG样品（?10 mg , 1.0 mL緩沖液中）受到50毫单位的P 1,4GT、 5 m mol的UDP-Gal 、和5 m mol的MnC12的24小时处理。加入另 一等 分部分的酶和UDP-Gal,并将混合物在37。C再孵育24小时。将去半乳 糖化的IgG样品用HiTmp蛋白A柱纯化。通过PNGaseF释放寡糖， 并如下所述通过MALDI-TOF-MS和HPLC f武予特征。

G2S2糖形的制备方法，包括根据厂商建议的方案，应用NAP-5柱 使IgG样品进入100 mM MES緩冲液(pH 7.0)中（~ 10 mg , 1.0 mL緩冲液 中）。向这种溶液中加入各自50毫单位的Pl,4GT和a2,3ST以及各自5 jumol的UDP-Gal、 CMP-Sm (NANA同分异构体)和MnCl2。将混合物 在37。C孵育。24小时后，随同核苷酸糖一起加入另一等分部分的酶， 并将混合物在37。C再孵育24小时。如上所述，将IgG样品的G2S2糖 形纯化。至于一种特定Abl G2S2批，Abl G2S2(lo)，初始连接的唾液酸 在随后的储存期间失去，或许由于污染了唾液酸酶。分析表明AM g2s2(lo)中仅有300/。Fc寡糖包含唾液酸,而Abl g2s2(hi)中~ 95%寡糖包 含唾液酸。

通过多种方法分析了 Ab制品的聚糖结构。为了进行完整IgGAb的 MALDI-TOF-MS分析，使IgG样品进入pH 7.0的10 mM Tns-HCl緩冲 液中并调节浓度至?1 mg/mL緩冲液。将大约2 ju 1 IgG溶液与2 jli 1基质溶液(基质溶液的制备方法，包括将10 mg芥子酸(smnapinic acid) 溶入1.0 ml的含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液中）混合，将2 ml的 这种溶液装载至草巴标并4吏之风干。应用Applied BioSystems的Voyager DE仪器(Foster City, CA),获得MALDI-TOF-MS。

为进行释出Fc聚糖的MALDI-TOF-MS分析，在体外糖基化反应之 前和之后，在37。C将IgG样品（~ 50 ju g)在pH 7.0的10 mM Tris-HCl buffer (50 ju 1)緩沖液中用PNGase F消化4小时。通过用50%乙酸（~5 |u l)将反应混合液酸化而终止消化，然后如先前所述通过阳离子交换树 脂柱(Papac等.,1996; Papac等.，1998; Raju等.，2000)。如同别处所述 (Papac等.，1996; Papac等.，1998;Raju等.，2000)应用 Applied BioSystems的Voyager DE仪器(Foster City, CA),通过阳和阴离子方式 的MALDI-TOF-MS，分析包含酸性和中性寡糖的混合物这些样品。

在37。C通过在pH 7.0的10 mM Tris-HCl buffer ( ~ 50 |u 1)緩冲液 中用PNGase F消化IgG样品（~ 50 ju g)4-8小时，进行Fc聚糖的HPLC 分析。如(参见Anumula KR, Anal Biochem. 2000 Jul 15;283(1):17陽26)所 述，将释出的寡糖用邻氨基苯曱酸(2-氨基苯曱酸)进行衍生化。简言之， 首先制备4%醋酸钠3H20(w/v)和2%硼酸(w/v)的曱醇溶液。然后通过 将~ 30 mg邻氨基苯甲酸(Aldrich)和~ 20 mg氰基硼氢化钠(Aldrich)溶解 在1.0 ml曱醇-醋酸-硼酸-钠（methanol-sodium acetate-borate)溶液中，得 到新鲜配制的衍生化试剂。在1.6ml聚丙烯螺旋帽的"O"环冷冻小瓶 (Sigma)中，将lgG衍生化寡糖(〈3 nmol , 20-50 ju 1水溶液)与0.1 ml 邻氨基苯曱酸(AA)试剂溶液混合并盖紧瓶盖。将小瓶用80。C的烘箱或加 热块(Reacti-Therm, Pierce)加热1-2小时。将小瓶冷却至室温后，用水稀 释样品使体积至~ 0.5 ml。通过应用NAP-5柱将书f生化寡糖纯化。

实施例3:与低亲和性细胞FC受体的结合

效应细胞上的几种类型的Fc受体中，Fcy型n和m被认为是低或 中等亲和性受体。 一般地，单体的结合可能亲和性太低而不能检测到或 为非常低的水平。例如，单体IgG与y型IIA的结合是很难测量的。这 些受体起作用与免疫复合物结合，这是由于它们更亲合的多效价的本质 结合，或许是由于复合物减慢的速率。

人K562细胞，它表达作为唯一的Fc y受体的Fc yRIIA,用于两种类型的结合测定，以测试Fc聚糖中酸唾液含量的改变是否影响与这种低亲和性人Fc y受体的结合。为了获得与Fc y RIIA(其对单体IgG具有 低亲和性）有足够亲合的结合，将抗TNF的测试Ab与同型三聚体 (homotrimeric)TNF以2:1摩尔比混合，制备免疫复合物，该比率显示^叉 产生痕量游离的Ab或游离的TNF。对免疫复合物的依赖进行了举例说 明，放射标记的Ab2单独在浓度高达1 ug/ml时不能检测到其与K562 细胞的结合，但是Ab2:TNF复合物在0.02 ug/m时显示显著的结合(未展 示数据）。

竟争结合形式.制备两组IgG免疫复合物，标记的复合物包含人 IgGl抗体，所述抗体对抗V区特异性非人类的Ab和Ab5的复合具有不 相关的特异性。为了建立标记的复合物，如先前所述(Kmght等.，1993) 应用IODO-GEN试剂，将嵌合体单克隆Ab(携带的仓鼠V区以及人IgGl 和轻链k恒定区)碘化。然后将仓鼠-人嵌合体V区个体基因型的特异性 大鼠IgG2a单克隆Ab以1:1摩尔比在PBS中混合30分钟，以形成放射 标记的免疫复合物。大鼠抗Id显示不能促成与FcyRIIA的直接结合， 当制备的复合物具有去糖基化的仓鼠-人嵌合体时，发生少的结合;然而 复合物具有未改性嵌合体的Ab时显示高水平的结合(未展示数据)。此 外，用于制备单独免疫复合物的试剂之间没有检测到交叉反应性，交叉 反应性可表明一种免疫复合物可能结合另一种免疫复合物（未展示数 据）。

为了测试复合物，室温下将唾液酸变体的Abl与人TNF同型三聚 体以2:1摩尔比(通过光散射分析显示，产生非常少的非结合的Ab和非 结合的TNF)在PBS中混合30分钟。在一组实马全中，将具有百分比20 和29的唾液酸的Abl天然变体的复合物彼此进行比较。在第二组实验 中，将Abl-29:TNF复合物与凝集素柱增强的制品Abl-43:TNF复合物进 行比较。在两种情况下对照复合物为Abl-Gno:TNF,其中抗体被酶除去 聚糖。

将人K562细胞以3 X 105细胞/孔接种在5% FBS的IMDM的96孔 板中。向不同量的测试抗体复合物中，加入定量的放射标记的抗体复合 物，然后向K562细胞中加入组合的混合物使得每孔含有终浓度0.1 w g/ml碘化的抗体复合物。将孔板在4。C孵育16-18小时，用5% FBS的 imdm洗涤三次除去非结合的Ab后，应用y计数器测定细胞结合的计数值。

结果.随着非标记竟争免疫复合物量的增加，会增加对放射标记免疫复合物结合的抑制。唾液酸变体，未改性的Abl(29。/。唾液酸化)和Abl MAAB(43。/。唾液酸化)显示：具有更高唾液酸化Ab的复合物与具有更4氐 唾液酸化Abl的复合物相比，产生相同程度的FcyRII结合需要5至10 倍的更高浓度(图4A)。至于相差9%唾液酸含量(20对29)的天然变体 Abl,对于更低唾液酸化制品来说相差大约4倍的更高亲合力（未展示）。 因此，在这种人IgG 1上存在唾液酸的NGNA同分异构体形式(作为鼠骨 髓瘤宿主细胞重组体表达的结果），减少了免疫复合物对人FcYRII的亲合力。

免疫复合物对K562细胞的结合.将Abl测试样品与1251-标记的人 TNF以2:1的固定摩尔比混合，然后向96孔培养皿中的3 X 105 K562 细胞中加入不同量的合成免疫复合物。AblG2:TNF复合物(无唾液酸化 的Ab)与AblG2S2(hi):TNF复合物（完全唾液酸化的Ab)的对比显示完全 唾液酸化的Ab具有亲合力非常小的结合，高唾液酸化的变体与无唾液 酸化的变体相比，达到相同程度的结合需要IO倍的更高浓度(图4B)。 这些结果表明唾液酸的NGNA同分异构体的存在(通过体外酶修饰的引 入)减少了抗体对人Fc y rii的亲合力，其可归因于对靶(TNF)结合亲和 力的减少，从而使Ab:TNF复合物的稳定性更低，减少恒定区对Fc受体 亲和性，或两者。

与细胞Fc y RIIIa结合的Ab.为了分析与天然杀伤细胞(NK)Fc y RIIIa结合的Ab,如上所述分离出人PBMC,然后应用NK细胞分离盒 (Miltenyi Biotec)通过磁细胞拣选从PBMC分离出NK纟田胞。在96孔板 中以每孔1 X 105细胞将NK细胞在37°C, 5% C02下的10% FBS的 DMEM培养基中培养过夜。将抗Fc y RIIIa mAb 3G822 (BD Biosciences Pharmingen)用碘化法试管（Pierce)标记1251至i文射性比度(specific activity) 为11 yCi/jug。将碘化的mAb 3G8与不同量的未标记的竟争剂Ab在 10% FBS的DMEM中预混合，向NK细胞中加入Ab混合物至硤化3G8 的终浓度为0.3 jug/ml。将细胞在4。C孵育16小时，然后用PBS洗涤4 次除去非结合的IgG。应用Y计数器测定CP结合细胞M的数值。

将在添加2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和10% FBS的RPMI 1640培养基(U-937培养基）中培养过的U-937细胞(没有为提高Fc yR表达进4亍预处理)接种至96孔泽反中，使每孔具有3 X 105细胞的50 Ml U-937培养基。将Ab2(人IgGl)标记1251至放射性比度为17 ju Ci/ ju g。 将碘化的Ab2 Ab与不同量的未标记的竟争剂Ab2在U-937培养基中预 混合。然后向50 ju 1 U-937细胞中加入50 m 1 Ab混合物，以使所有孔 中碘化Ab3的终浓度为0.2 jug/ml。将细胞在4。C孵育16小时，然后用 U-937培养液洗涤三次除去非结合的IgG。应用Y计数器测定CPM结合 细胞的数值。

为了测试Ab变体是否对Fc y RIIIa显示差别亲和力，新分离的NK 细胞是从健康人捐献者中分离出的，并用于竟争结合实验，所述实验包 括放射标记的mAb 3G8、与Fc竟争结合的抗Fc y RIIIa Ab、和作为竟争 剂的非标记的Ab。游离的、未复合的Ab用于代替免疫复合物(其通常 显示对cyRIIIa非常大的结合)，以便结果不会被可溶免疫复合物本身的 稳定性差异所困惑，所述稳定性差异可能受到Fc唾液酸含量的影响(我 们的未公布的数据）。这些结果显示更高唾液酸化天然变体Abl(Ab 1-29) 对NK细胞上的Fc YRIIIa具有减少的亲和力，与Ab l-20相比达到相同 程度的结合需要4倍的更高浓度(图5A)。对于天然变体Ab5具有相似 的差异，其中与Ab5-0相比，竟争对抗mAb3G8至相同的程度，Ab5-26 需要5倍的更高浓度(图5B)。当应用至少两者不同供血者的NK细胞(没 有展示数据；没有测定Fc yRIIIa异型）时，在各自的实验中观察到相似 的结果。这些结果表明唾液酸化的更高水平可减少IgG对FcyRIIIa的 亲和力，因此，几乎必然地促成所测到的ADCC活性降低。

当用凝集素分级分离所衍生的成对变体进行同样的实验时，然而观 察到更高唾液酸化的变体与FcyRIIIa结合正如更低唾液酸化的变体的 结合，且也许稍更好些（图5C和5D)。两队天然变体和两队凝集素衍生 变体的不同结果的原因是未知的，但是相当大的可能性是唾液酸残基存 在的位置的差异。

实施例4:体外ADCC测定

抗TNF Ab靶细胞包含Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系，在其表面稳定表 达由于导入删除1-12位氨基酸的成熟TNF而保4争^争膜形式的重组体人 TNF(Perez等.，1990)。将K2细胞在伊思考夫培养基中培养，所述培养 基包含热灭活的FBS、 2mML-氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、O.lmM非必需的氨基酸、和MHX。培养基和添加物购自Gibco (Invitrogen)。将细胞每 2-3天传代l:5。测定的当天，将K2细胞离心并用PBS洗涤一次。将细 胞用培养液调至大约1 x 106细胞/ml,加入15微升BATDA荧光标记试 剂(于Delfia EuTDA Cytotoxicity Reagent Kit中，Perkin陽Elmer Life Sciences)至5 ml的细胞中（Blomberg等.,1996)。在37。C将细胞孵育30 分钟，然后用PBS在5分钟1000 rpm下，洗涤两次。与PBMC效应细 胞混合即时前，将耙细胞离心，并以2xl()S细胞/ml再悬浮于含1%BSA 的伊思考夫培养基中。

在收集血液至肝素化真空采血管(vacutainer)并用PBS稀释两倍后， 从健康捐献者中分离出PBMC效应细胞。在50ml圓锥形管中，将三十 ml稀释的血液分层置于Ficoll-Paque (Amersham, Uppsala, Sweden)上部 15 ml,并在室温(RT)1500 rpm离心30分钟。收集含PBMC的分界面（阻 挡层），用PBS洗涤两次，在RT,以1200 rpm离心10分钟。将细胞再 悬浮于^f尹思考夫培养基中，所述培养基包含5%热灭活的FBS、 2mML-氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和O.l mM非必需的氨基酸。在37°C 5% C02 通过在100 mm组织培养皿(Corning)上孵育，将PBMC活化大约4小时， 所述培养皿之前涂有OKT3 (10 ug/ml的PBS, Ortho Pharmaceutical)并在 4。C过夜并用PBS清洗。收集PBMC,用含1% BSA的伊思考夫培养基 洗涤一次；计数并再悬浮至大约1 x 107细胞/ml。

将AM的测试样品包括阴性对照变体AM Gno,连续用伊思考夫 -1% BSA培养液稀释。向圆底96孔皿(Cornmg)中加入50微升的耙细胞 (~ 10,000)和100微升的抗体。向混合物中加入五十（50)微升效应细胞（~ 500,000细胞），将孔皿在RT下以1000 rpm离心5分钟。E:T的比值通 常为50:1，然而有时用35:1的比值。至于背景荧光，将孔与效应细胞、 靶细胞和培养基一起孵育。至于最大的荧光，向背景孔中加入10微升 溶胞液(来自Delfia EuTDA Cytotoxicity kit)。至于ADCC测定，在37°C 5% C02下将细胞孵育大约2小时。将20微升的上清液转移至96孔平 底板（Cornmg)。在RT下，力口入200微升的铕溶液(Delfia EuTDA CytotoxcityKit),并将板置于平板摇床振荡10分钟。在时间分辨的荧光 i十En Vision Instrument (Perkin-Elmer Life Sciences)中测定焚光。才艮寺居下 式计算各自样品特异性溶胞的百分数:％特异性释放=([实验释放-自发释放]+ [最大释放-自发释放])X 100 。

39唾液酸效应的最初评价集中于两队天然变体的体外ADCC活性。将 Abl-29和Abl-20以不同的浓度同铕标记的表达Agl的靶细胞一起孵育。 如图6A所示，在细胞毒性活力中具有明确的差异，其中Fc唾液酸化更 高水平的Abl-29与Abl-20相比，为激发细胞溶解至相同程度，需要大 约7倍的更高浓度。这些结果表明富集唾液酸化糖形的AM子批，Abl MAAB,比未改性的Abl PBS具有更少的效力。达到Abl PBS-29。/o样品 相同量的溶胞作用需要大约3倍值的Abl MAAB-43。/。物质。对于成对的 Ab2天然变体，表达Ag5靶细胞的实验显示为同样的模式。为了达到不 含可检测量唾液酸的Ab2-0变体相同程度的溶胞作用，需要大约6倍的 更高浓度的Ab2-26(如图6B所示）。因此，天然糖基化变体对这种ADCC 的测量值的作用不是Ab或靶特异性的。

在比较Abl子批(基于凝集素分级分离后它们的唾液酸含量不同）的 ADCC活性的代表性实验中，比较AM MAAB(43q/o唾液酸化)与衍生的 未改性的Abl批(Abl PBS)。在比较唾液酸含量不同的Abl子批的第二 个实-验中，将Abl WGAT (29%唾液酸化）、AblWGAR(40%唾液酸化) 和Abl WGAB(32%唾液酸化)相互进行比较。

测定的结果也证明了在ADCC测定中唾液酸含量和潜能之间存在 反相关的关系，而不考虑制备Ab的方式（图6C)。就是说，含有与未改 性的Abl大约相同唾液酸量的Abl WGAT展示了与未改性的Abl相同 的活性。然而，WGA制备的部分随着唾液酸含量的增加失去了潜能（图 6C)。

实验中，比较了唾液酸量差别更大的两种样品:酶改性的Abl G2(0% 唾液酸化）和Abl G2S2(hi)( ~ 95%唾液酸化）。通过密度离心法，在 Ficoll-Paque中分离出新鲜的PBMC。将于100 ml体积中的5 X 105 PBMC 与不同量的未处理的Abl、 AblG2S2(hi)(完全半乳糖化和唾液酸化）、或 Ab7(同种型配对的阴性对照Ab)—起预孵育大约10分钟。表达表面结合 的重组体人TNF的K2细胞被用作輩巴标并标记200 mCi51Cr。将标记的 细胞加至PBMC/Ab混合物中，在1000 rpm离心1分钟，然后在37°C孵 育4小时。已知孵育时间（4小时)可出现NK细胞(在PBMC细胞种群内） 引发的初始细胞的溶解，NK细胞表达Fc yRIIIA, FcyRIIIA不是由巨 噬细胞表达，巨噬细胞通常表达Fc yRI (cd64)、 Fc yRIIA (cd32a)、 和FcyRIIIA(CD 16A)。然后应用Topcount测定细胞上清液中放射活性2006数。所示的结果（图6D)代表两个应用不同捐献者的PBMC所完成的独 立试验，完全唾液酸化的Ab和几乎去唾液酸化的Ab之间在细胞溶解的 能力显示出大于IO倍的变化。

在ADCC测定中也比较了其它成对的Ab制品。在ADCC测定中应 用表达Ag2的耙细胞，评价了由半乳糖化Ab2制成的WGA凝集素部分。 此外，更高唾液酸化的物质具有更少的活性，然而在EC5o值上只有4 倍的差异，尽管在唾液酸含量(5%对67%)存在更大的差异。比较起来， 由Abl制成的WGA凝集素部分表明41%唾液酸化变体与29%唾液酸化 变体相比，达到相同程度的细胞溶解需要大约6倍的更高浓度。

所有测试的三对Ab的这些结果一致地表明Fc唾液酸的高水平与降 低的ADCC活性相关。虽然没有定量，ADCC活性的量级变化与Ab制 品唾液酸含量的量级变化之间的差异在四种Abl变体组内存在一致的 关系，其中Abl-20、 Abl-29、 Abl-WGA-29、和Abl-WGA-41的EC5。值 一4殳分别0.3 ng/ml、 2 ng/ml、 2 ng/ml和10 ng/ml。凝集素部分的结果也 证实了唾液酸化Ab制品包含ADCC活性不同水平的分子种类。值得注 意的是，除Ab3-0和Ab3-26之外，本文所分析的变体没有显示达到溶 胞最大水平差异的趋向。

由于这种方法测量的ADCC活性主要是由Fc y RIIIA阳性NK细胞 所介导的，数据意味着鉴于Fc寡糖中唾液酸的存在增强与FcyRI的结 合，其存在显著减少了与FcyRIIIA的结合。

实施例5:高亲和性细胞的FC受体的结合

在人单核细胞的细胞系U-937细胞上应用竟争结合形式，测量唾液 酸含量不同的受试Ab对高亲和性人Fc受体FciRI(CD64)的结合。在T 烧瓶中，将U-937细月包在2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和10% FBS 的RPMI 1640培养基中培养，且在37。C用5%002维持培养器。应用碘 化剂（IODO-Gen)预涂渍碘化管,将Ab2(鼠/人IgGl嵌合体Ab)碘化至放射 性比度为17.2 mCi/mg。将U-937细胞以6 x 106细胞/ml再悬浮于新鲜的 培养基中，然后通过过滤器以每孔3 X 105细胞密度接种至Millipore 96 孔组织培养板中。这些细胞没有进行预处理以产生更高的Fc丄R表达。 在50 yl的体积中，应用培养基作为稀释液将碘化的Ab2与不同量的 未标记的Mab竟争剂（测试样品)预混合。然后将混合物加至U-937细胞的50 jul培养基中，得到最终碘化Ab2的浓度为0.2 ng/ml。然后将细 胞在4。C孵育16小时。用培养液清洗以除去非结合的IgG,应用板真空 系统抽吸三次。应用Y计数器测定细胞结合的计数值。

图7 A展示与AblG2(无唾液酸)相比，Abl G2S2(hi)( ~ 95%唾液酸 化)与U-937细胞上的高亲和性FcR (CD64)的结合具有5 ~ 10倍更高的 亲和性，亦即,Abl G2S2(hi)达到抑制碘化Ab2结合的相同程度时，只需 要五分之一至十分之一的浓度。没有4企测到Abl G2与未处理的Ab之间 的差异(数据未展示），未处理的Ab是不同糖形的异种混合物，其大多数 含有比Abl G2样品更少的半乳糖（即GO和Gl糖形）。

图7B展示了两种不同批次的Ab3具有不同量的带电荷寡糖种类 (含有唾液酸的种类），或者为总寡糖的2%或42%，同样表明了具有更高 唾液酸含量为特;[正的批次对Fc y RI具有更高的亲和性。

在观察到两队天然糖基化变体Abl和Ab5中更高唾液酸含量的抗 体制品具有与NK细胞Fc YRIIIa减少的结合后（实施例3,图5A和B), 这些结果的可能性被认为是由于带负电荷的唾液酸和带负电荷的细胞 表面之间简单的静电排斥。然而,唾液酸含量对人U-937细胞Fc yRI受 体的结合亲和性的相反影响并没有遵循Ab5或其它Ab的相同模式(数据 未显示)。

应当指明的是，鉴于两种Abl样品在缺失/存在唾液酸NANA形式 中的不同，因而认为两种Ab3样品在唾液酸NANA形式的量上不同（鼠 宿主细胞生产的）。

实施例6:血清半衰期的测量

在本实施例中，将含有Fc的融合蛋白（其包含与小鼠骨髓瘤细胞表 达的抗体可变区序列和人IgGl铰链、CH2和CH3区域稠合的N末端肽) 处理以形成完全唾液酸化(G2S2)的形式。对正常雌性CD1大鼠(每处理 组4个)静脉注射给予未改性的形式的FcPl(其含有5%唾液酸化的Fc寡 糖）或将完全唾液酸化型式（~ 98。/。唾液酸化）由I,月永内分组注射^会J难性 CD1大鼠。在1小时、5小时、24小时、72小时、7天、14天、和21 天通过后眼窝取血收集血液，然后在28天通过对c02麻醉的动物进行 心脏穿刺的最后采血。由血样制备血清，应用比色法ELISA测量血清中 人Fc的浓度。简言之，首先将96孔EIA板涂上多克隆的山羊抗人Fc抗体。在室温下将不同稀释度的血清样品在孔中孵育1小时。通过清洗 除去非结合的蛋白质，根据适当的着色底物，应用酶结合的山羊抗人IgG抗体测定结合的人Fc。

图8中显示了研究结果。未改性抗体计算的曲线下面积(AUC)为95 ± 1.6天.ng/mlXK)-3和48 ± 1.9天? ng/mlX10-3。这表明Fc寡糖中 更高程度的唾液酸化与正常大鼠中更快的清除速率有关。

在第二个实验中，给正常小鼠注入单个3 mg/kg剂量的酶修改为完 全无唾液酸化或（G2)完全唾液酸化(G2S2)的Ab2。应用如上所述的比色 法ELISA,监测和测量血清中的人Fc。图9中显示了此实验结果。在大 约一周时期后，Ab2 G2S2开始被更快地从小鼠血清中清除,至第20天血 清中剩下的Ab2 G2S2大约1000倍地小于Ab2-G2的浓度。

小鼠体循环中Abl唾液酸变体的清除

在注射含有与AM结合的异种混合聚糖种类的样品后，通过定量测 定各个糖基化种类的血清清除速率，进行唾液酸含量效应的另一种直接 测量。

以20 mg/kg的剂量给18个正常的8-10周龄的Balb/c小鼠腹腔内注 入同样的异种糖基化的制品Abl。在第3天从6个小鼠中、在第6天从 另外6个小鼠中和在第28天从最后6个小鼠中采集血液。从各个血样 中制备血清，应用Abl V区特异性抗Id亲和柱，将血清中的Abl重纯 化。然后通过HPLC分析对重纯化的Abl样品的Fc聚糖的结构进行分 析，如本文先前所述测定各种糖形的相对比例。

发现了缺乏唾液酸的半乳糖化糖形（G2S0)在小鼠4周期内保持其相 对丰度，而含有1个唾液酸聚糖(G2S1)的Ab糖形和2个唾液酸(G2S2) 糖形以更快的速度^f皮清除。

因此，与无唾液酸4t或部分唾液酸^:组成相比，含完全唾液酸4匕的 Fc蛋白质具有更短的血清半衰期。

实施例7:唾液酸含量和抗体亲合力

此处所述的结果支持Fc区域(二聚化铰链-CH2-CH3)Fc聚糖中的唾 液酸含量的变化将影响整个蛋白质的理论。至于包含糖基化Fc的二价 抗体和融合蛋白，这种影响可在蛋白质对特异靶标的亲合力中得到证 明。进行本实施例的实验以验证这种理论，并进一步证实唾液酸含量对靶结合亲合力的特异性作用。

与细胞表面抗原的结合.在结合测定中应用上述ADCC测定中所用 的表达Ag的相同细胞系，以测试唾液酸变体之间在其抗原结合亲合力中的差别。测定以竟争形式进行，其中将一个放射标记的Ab(Abl、 Ab2、 或Ab5)保持固定的浓度与表达Ag的细胞一起在不同量的未标记的测试 Ab存在下孵育。通过碘化剂方法制备的捵化的Ab通常为10 uCi/ug的 放射性比度。

在5% FBS的MDM培养基中，将表达表面TNF的细胞以每孔50,000 个细胞和表达Ag2的细胞以每孔180,000个细胞接种于96孔组织培养 皿。将适当的1251标记的Ab与滴定量的测试Ab预混合，并将混合物加 到适当表达Ag2的细胞中。在RT将皿孵育2小时以使Ab与细胞结合。 用5% FBS的IMDM将这些细月包清洗三次以除去非结合的Ab,然后应用Y计数器测定细胞结合的计数值。

至于Ab5变体，在50 ju 1 10% FBS的DMEM中，将表达Ag5的细 胞以每孔186,000个细胞接种于96孔组织培养皿。将1251标记的Ab2与 滴定量的测试Ab预混合，并将50 )i 1混合物加到适当表达Ag的细胞 中。在4。C将皿孵育16小时以使Ab与细胞抗原结合。然后用10%FBS 的DMEM将这些细胞清洗三次以除去非结合的Ab,然后应用y计数器 测定细胞结合的计数值。将样品一式双份或四份进行检测，所示结果表 示3或4次独立试验的结果。按照平方和增量F-检验确定时，这些测试 样品之间的结合差异是显著的(P〈0.0001,图a、 c、和d)。

这些结果展示在图10A-D中：在作为竟争剂的未标记Abl天然变 体存在下，放射标记的Abl与表达Agl细胞的结合（图10A);在作为竟 争剂的未标记Ab5天然变体存在下，放射标记的Ab5与表达Ag5细胞 的结合(图10B);在作为竟争剂的未标记Abl凝集素衍生变体存在下， 放射标记的Abl与表达Agl细胞的结合(图10C);在作为竟争剂的未标 记Ab3凝集素衍生变体存在下，放射标记的Ab3与表达Ag3细胞的结 合（图IOD)。

与固相配体结合的Ab.通过向每个孔中加入于PBS中的浓度为1 jug/ml的50 MlAg或抗IdAb,并将板在4°C孵育过^复， -使重组可溶的 TNF或抗Id2涂布在EIA板上。将孔清洗，然后在RT用50 ju 1 1% BSA、 0.125%明胶的PBS预处理1小时，以使非特异性结合降到最低。将1251标记的Abl或1251标记的Ab3在5% FBS的IMDM中分别与滴定量的各 个测试Ab制品预混合，并将50 jul混合物加到涂布耙标的孔中。所有 孔中放射标记的Ab终浓度为100 ng/ml。在RT将这些板孵育2小时以 使Ab与涂布的耙标结合。将这些孔清洗以除去非结合的Ab,然后应用 Y计数器测定结合的计数值。

板上涂布的Ab与可溶性抗原的结合.将96孔板涂上唾液酸变体 Abl和Ab3,然后与不同量的放射标记的可溶性抗原一起孵育如下:(a) 放射标记的可溶Agl与板上涂布的AM天然变体的结合,(b)放射标记的 可溶Agl与板上涂布的Abl凝集素分级分离的变体的结合,和(c)放射标 记的可溶Ag3与板上涂布的Ab3凝集素分级分离的变体的结合。用放射 标记的Ag和IO(H咅过量的未标记的Ag进4亍对比孵育，以测定非特异性 结合。样品一式三份进行测试。由于没有可利用的可溶Ag2,没有分析 Ab2变体。

统计分对斤.通过比较曲线并同时应用4-参数的逻辑回归（logistic regression):共同的最小数、最大数和斜率(根据初步试验的斜率)和对于 零浓度所得到的共同稳态水平（common plateau)的范围（亦即,通常假定 对于递增曲线没有测验共同的"底部"和对于递减曲线没有测验共同的 顶部），分析了抗体变体之间的效能差异。在GraphPad Prism v4中用平 方和增量F-检验进行显著性检验。P值〈0.05被认为有显著性。对CPM 分析被CPM2相反地加权，因为CPM的标准差对其平均值按比例地增 力口 （亦即，CPM变异系数CV与平均值是不相关的）。

结果

应用ADCC测定所用的表达Ag相同的靶细胞，以竟争形式所进行 的的抗原结合实-验出乎意料地显示了与Abl-20相比，Abl-29 —致地结 合细胞表面抗原，具有大约3倍的更低亲和性（图10A)。相反地，Ab5-26 显示与Ab5-0不能区别的亲和性（图IOB)。用两队凝集素衍生的变体所 进行的相同测定显示与Abl天然变体类似的结果，亦即,更高唾液酸化 的Abl-WGA-41与4交少唾液酸化的Abl-WGA-29相比，达到相同程度的 竟争性结合需要4至6倍的更高浓度（图10C),和更高唾液酸化的 Ab2-GT-WGA-67与较少唾液酸化的Ab2-GT-WGA-5，需要4至6倍的 更高浓度（图1 OD)。

有趣地，在测定与固定在96孔EIA一反上的耙(可溶重组体抗原或抗45Id Ab)结合的实-验中，也观察到更高量的唾液酸化Abl和Ab2变体具有 降低结合的相同模式（图11A和B)。这些结果表明Fc唾液酸化程度的 差异可能影响到与抗原以及FcyRIIIA的结合，但是唾液酸化的程度不 能影响所有的Ab结合抗原。

根据固定靶结合的数据，可以认为增加Fc唾液酸化可用于降低Ab 铰链区的柔性。在Abl和Ab2结合细胞表面抗原的情形中，降低铰链柔 性可导致更多的单价结合和更少的二价(高亲合力）结合到抗原，这取决 于固体载体或细胞表面上的抗原表位的间距。Ab5铰链区也可降低柔性， 但是这种Ab达到与Ag5最大结合可能不需要这种柔性。

为了区别Ab的柔性效应或固有结合亲和性的变化之间是否受到Fc 唾液酸化的影响，测试了 Ab与可溶配体的结合，作为纯粹单〗介亲和性 的结合。这些结果确实表明了：对于在与细胞表面抗原结合中表现出差 异的三对唾液酸变体，在它们与可溶^i结合中成对变体之间没有，见察到 可检测的差异(图12A-C)。 一并考虑，这些结果证实了与固定靶(细胞表 面或板上涂布的）结合的这些差异不是由于各个Fab臂和靶之间的固有 亲和力的差异。因此，Abl和Ab2唾液酸变体在它们与固定革巴结合之间 的这些差异是由于与细胞二价结合程度的差异。

应当澄明本发明可以以除前述说明书和实施例中具体所述之外的 方式实施。根据上述教导对本发明进行众多的修饰和变更是可能的，这 在所附权利要求的范围内。

权利要求

1. 控制含有Fc的分子性质的方法，包含改变Fc区域寡糖的唾液酸化。

2. 权利要求l的方法，其中唾液酸化在Fc区域是增加的。

3. 权利要求1的方法，其中控制的性质选自对一种或多种FcyRI、 Fey RIIA和Fcy RIIIA受体的亲和力，ADCC活性，巨噬细胞或单核细 胞活化，血清半衰期，和亲合力。

4. 权利要求l的方法，其中通过至少一种选自：酶处理、酶改性分 子、基因操纵分子、凝集素色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法、疏 水作用色谱法、尺寸排阻色谱法、改变用于蛋白质表达的细胞系、用于 血清中产生含有Fc蛋白质的宿主细胞培养、和将蛋白质暴露给多种pH 环境的方法，对野生型Fc区域进行所述的唾液酸化改变。

5. — 又利要求4的方法，其中酶处理包含用唾液酸酶或唾液酸转移酶 处理。

6. 权利要求1的方法，其中含有Fc的分子具有对靶的特异性结合 区域，所述耙为固定靶。

7. 权利要求1的方法，其中含有Fc的分子具有对靶的特异性结合 区域，所述輩巴为细胞表面上表达的輩巴。

8. 权利要求l的方法，其中含有Fc的分子为抗体。

9. 控制含有Fc治疗蛋白质性质的方法，所述蛋白质的特征为在其 CH2免疫球蛋白区具有与天冬酰胺残基共价连接的双触角寡糖，该方法 包括将含有Fc治疗蛋白质的非G2S2糖形转化成基本上为G2S2唾液酸 化糖形的寡糖。

10. 权利要求9的方法，其中所述的含有Fc蛋白质与含有相同Fc 的非G2S2糖形的治疗蛋白质相比具有一种多种选自下列的性质：降低 对Fc y riia和Fc y riiia的亲和力、降低NK细胞介导的adcc测定 中的活性、提高对FcyRI的亲和力、提高活化巨噬细胞的能力、和更 短的血清半衰期。

11. 权利要求9的方法,其中转化步骤包括酶工程的重组表达单克隆 抗体、应用色谱法富集特定的糖形、应用唾液酸转移酶以增加唾液酸残 基、和改变用于蛋白质表达的细胞系中的至少一个步骤。

12. 权利要求ll的方法，其中色谱法包括凝集素亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色语法、或尺寸排阻色谱法。

13. 权利要求12的方法，其中基因工程掺入糖基转移酶。

14. 控制含有Fc治疗蛋白质性质的方法，所述蛋白质的特征为在其 CH2免疫球蛋白区具有与天冬酰胺残基共价连接的双触角寡糖，该方法 包括将含有Fc治疗蛋白质的G2S2糖形转化成基本上为G2、 Gl、或G) 的无唾液酸化糖形的寡糖。

15. 权利要求14的方法，其中所述的含有Fc蛋白质与含有相同 Fc的基本上为G2S2唾液酸化糖形的治疗蛋白质相比具有一种多种选自 下列的性质：提高对FcyRIIA和FcyRIIIA的亲和力、提高NK细胞 介导的ADCC测定中的活性、降低对Fc Y RI的亲和力、降低活化巨噬 细胞的能力、和更长的血清半衰期。

16. 通过权利要求1-15的任何一项的方法生产或改变的含有Fc的 蛋白质。

17. 含有Fc的基本上为G2S2唾液酸化糖形的治疗蛋白质，所述蛋 白质的特征为在其CH2免疫球蛋白区具有与天冬酰胺残基共价连接的 双触角寡糖，其中所述含有Fc的蛋白质与含有相同Fc的基本上为无唾 液酸化GO、 Gl、或G2糖形的治疗蛋白质的制品相比具有：降低对Fc Y RIIA和Fc Y RIIIA的亲和力、降低NK细胞介导的ADCC测定中的 活性、提高对FcyRI的亲和力、提高活化巨噬细胞的能力、和更短的 血清半衰期。

18. 权利要求17的蛋白质，其中该蛋白质靶结合区域所结合的靶为 固定的靶。

19. 权利要求17的蛋白质，其中该蛋白质结合区域所结合的靶为细 胞表面上表达的耙。

20. 权利要求17-19的任何一项的蛋白质，其中该蛋白质适用于治 疗肿瘤学相关的病症、慢性疾病、或感染性疾病。

21. 权利要求20的蛋白质，其中感染性疾病涉及FcR介导的调理抗 体rantibodv-ODsmized)的细l包或包i舌病毒和细菌之一或此两者的斗立子的 清除率，和需要长期治疗的慢性疾病。

22. 权利要求17的蛋白质，其中该蛋白质包括重组体表达的单克隆 抗体、应用唾液酸转移酶的酶改性抗体，具有用凝集素亲和色谱法富集 的特定糖形、或具有用唾液酸酶除去的唾液酸残基。

23. 权利要求17的蛋白质，其中该蛋白质为应用亲和色谱法、离子交换色语法、疏水作用色语法、和尺寸排阻色语法中的一种或多种方法 所纯化的重组体表达的单克隆抗体。

24. 权利要求23的蛋白质，其中亲和色谱法为凝集素亲和色谱法。

25. 权利要求17的蛋白质，其中所述蛋白质为遗传工程学宿主细胞 中表达的单克隆抗体，具有提高水平的唾液酸化或无唾液酸化的单克隆 抗体。

26. 含有Fc的基本上为无唾液酸化GO、 Gl、或G2糖形的治疗蛋 白质，所述蛋白质的特征为在其CH2免疫球蛋白区具有与天冬酰胺残基 共价连接的双触角寡糖，其中所述含有Fc的蛋白质与含有相同Fc的基 本上为G2S2糖形的治疗蛋白质相比具有：提高对FcyRIIA和Fc y RIIIA的亲和力、提高NK细胞介导的ADCC测定中的活性、降低对Fc yRI的亲和力、降低活化巨噬细胞的能力、和延长的血清半衰期。

27. 权利要求26的蛋白质，其适用于治疗肿瘤学相关的指征和病症。

28. 权利要求26的蛋白质，其中胂瘤学相关的指征为非霍奇金淋巴瘤。

29. 权利要求26的蛋白质，其中该蛋白质为应用唾液酸转移酶或唾 液酸酶的酶改性的重组表达的单克隆抗体。

30. 权利要求26的蛋白质，其中该蛋白质为应用亲和色谱法、离子 交换色语法、疏水作用色谱法、和尺寸排阻色语法中的一种或多种方法 所纯化的重组表达的单克隆抗体。

31. 权利要求30的蛋白质，其中亲和色谱法为凝集素亲和色谱法。

32. 权利要求30的蛋白质，其中所述蛋白质为宿主细胞中遗传工 程表达的单克隆抗体，具有提高水平的唾液酸化或无唾液酸化的寡糖。

33. 权利要求17或30的蛋白质，其中所述蛋白质选自Abl、 Ab2、 Ab3、 或Ab5。

34. 制备含有治疗重组Fc的蛋白质批的方法，所述蛋白质的特征包 含至少铰链区、CH2、 C和H3域的免疫球蛋白IgG同型区域，其中该 方法包括用酶处理该批，以增加或除去与所述蛋白质连接的多糖链上的糖残基。

35. 药物组合物，包含权利要求34的方法所生产的蛋白质和药学上 可接受的载体。

36. 权利要求35的方法所生产的蛋白质的应用方法，用于治疗或诊 断疾病或病症。

37. 权利要求36的方法，其中所述的蛋白质用于治疗选自癌、淋巴 瘤、肉瘤、和骨髓瘤的肿瘤性疾病。

38. 权利要求36的方法，其中所述的蛋白质用于治疗选自银屑病、 风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、炎性肠病、克罗恩氏病、和系统性红斑 狼疮的炎症性疾病。

39. 权利要求36的方法，其中所述的蛋白质用于治疗涉及角膜或视 网膜新生血管化的疾病。

40. 控制具有特异性靶结合区域的含有Fc分子靶的结合亲和性的 方法，包括在Fc区域改变寡糖的唾液酸化。

41. 权利要求40的方法，其中所述的唾液酸化在Fc区域是增加的 且亲合力是降低的。

42. 权利要求40的方法，其中所述的唾液酸化在Fc区域是降低的 且亲合力是增加的。

43. ^又利要求40的方法，其中通过至少一种选自：酶处理、酶改 性分子、基因操纵分子、凝集素色谱法、亲和色语法、离子交换色语法、 疏水作用色谱法、尺寸排阻色谱法、改变用于蛋白质表达的细胞系、用 于血清中产生含有Fc蛋白质的宿主细胞培养、和将蛋白质暴露给多种 pH环境的方法，对野生型Fc区域进行所述的唾液酸化改变。

44. 权利要求43的方法，其中酶处理包含用唾液酸酶或唾液酸转 移酵处理。

45. 权利要求40的方法，其中所述的耙为固定耙。

46. 权利要求40的方法，其中所述的耙为细胞表面上表达的耙。

47. 权利要求40的方法，其中含有Fc的分子为抗体。

48. 本文所述的任何发明。