Plus推荐 | 2018Science：Notch配体Dll1介导乳腺干细胞与巨噬微环境的互作

编者导语

成体干细胞的维持与功能发挥高度依赖其所在的微环境，干细胞与微环境之间的互作（Crosstalk）是成体干细胞领域经久不衰的研究热点。作为青春期才开始发育的器官，乳腺的发育受到了激素等的精准调控。尽管在过去几十年里人们对于乳腺发育的干细胞树已逐渐阐明清楚，但对于微环境与乳腺干细胞之间的关系还尚未完全阐明。最近，Science发表了普林斯顿大学康毅滨课题组的一篇Research Article，揭示了Dll1（Notch配体）介导了乳腺干细胞与微环境中巨噬细胞的互作——即：1. 乳腺干细胞表达Dll1（作为关键的信号分子）--->2. 直接激活周围巨噬细胞的Notch通路，增强Wnt因子的表达--->3. 来自巨噬细胞的Wnt因子（以旁分泌的形式）促进乳腺干细胞自我更新。这项研究首次证实了乳腺组织中巨噬细胞对乳腺干细胞的调节作用，参与乳腺发育与稳态维持。

关键词：乳腺干细胞；巨噬细胞；Dll1；Notch通路；Wnt通路

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论文简介

摘要

    The stem cell niche is a specialized environment that dictates stem cell function during development and homeostasis. Here, we show that Dll1, a Notch pathway ligand, is enriched in mammary gland stem cells (MaSCs) and mediates critical interactions with stromal macrophages in the surrounding niche. Conditional deletion of Dll1 reduced the number of MaSCs and impaired ductal morphogenesis in the mammary gland. Moreover, MaSC-expressed Dll1 activates Notch signaling in stromal macrophages, increasing their expression of Wnt family ligands such as Wnt3, Wnt10A, and Wnt16, thereby initiating a feed back loop that promotes the function of Dll1+ MaSCs. Together, these findings reveal functionally important cross-talk between MaSCs and their macrophageal niche through Dll1/Notch-mediated signaling.

Working model

PMID: 29773667； DOI: 10.1126/science.aan4153

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主要发现

一、乳腺形态发生需要Dll1

        文章首先通过基因表达分析发现Dll1主要在basal（P4, Lin⁻CD24⁺CD29^hi）细胞中表达,而在luminal（P5, Lin⁻CD24⁺CD29^lo）和stromal-enriched（P6, Lin⁻CD24^loCD29^lo）细胞中低表达。而basal细胞已被报道富含乳腺干细胞（MaSC），这些数据提示了Dll1在MaSC中可能存在调节作用。

    于是，他们构建了在basal和luminal细胞中条件性敲除Dll1的小鼠Dll1^cKO（K14-Cre/Dll1^f/f），发现与同窝野生型小鼠相比，Dll1^cKO小鼠的乳腺导管伸长和分支显著降低，Ki67和EdU染色显示在Dll1^cKO 乳腺中增殖性乳腺上皮细胞（MECs）较少。

二、Dll1对于维持MaSC数量至关重要

由于Dll1主要在basal细胞中表达，而basal细胞富含乳腺干细胞，接下来研究人员开始研究Dll1^cKO 小鼠的MaSC的数量和功能。FACS分析显示Dll1^cKO小鼠中富含MaSC的P4群体显著降低。限制稀释清除的脂肪垫复育测定也显示从Dll1^cKO小鼠获得的谱系阴性活细胞（Lin-，即CD31-，Ter119-和CD45-）的再次繁殖频率显著减少，而在移植前通过慢病毒转导在MEC中过表达Dll1则增加了MaSC的再增殖频率。令人惊讶的是，WT和Dll1^cKOP4细胞之间没有观察到显著差异。研究表明Dll1对于维持乳腺发育不同阶段的MaSC数量至关重要。

三、Dll1+细胞富集MaSCs

为了进一步研究Dll1在乳腺中的功能和表达，他们使用了Dll1-mCherry转基因小鼠模型。结果表明，在乳腺中，Dll1-mCherry报告基因在所有发育阶段主要表达于基底细胞。FACS分析表明大约12％的Lin-细胞在virgin小鼠中是Dll1^mCherry阳性的,且Dll1^mCherry 表达主要富集在P4群体的右上部分，P4-Dll1⁺细胞具有更高的再增殖频率，这表明Dll1⁺细胞代表了富含MaSC的群体的一个子集。此外，P4-Dll1^hi 基底细胞相对于P4-Dll1^low基底细胞具有增加的重建潜力。基因组富集分析（GSEA）证实P4-Dll1^hi 细胞富含MaSC特征，而P4-Dll1^low 细胞富含luminal特征。以上结果支持了支持Dll1在MaSC细胞中富集的观点。

四、富含Dll1+的MaSCs可产生basal和luminal细胞

为了检测乳腺发育过程中Dll1+细胞的功能，他们使用了Dll1-GFP-IRES-Cre-ERT2小鼠模型进行了谱系追踪实验。与在Dll1^mCherry小鼠中观察到的类似，Dll1^GFP 主要在基底细胞中表达。为了追踪Dll1^GFP+ 细胞的命运，将Dlll-GFP-IRES-Cre-ERT2小鼠与tdTomato报告小鼠交配，得到的P0代用他莫昔芬初始诱导后在不同时间点追踪tdTomato表达，在早期时间点（诱导后2天）的FACS分析显示tdTomato主要在基底细胞中表达。3D全局染色和共聚焦成像进一步证实了K14⁺K8⁻基底细胞中tdTomato的表达。在诱导后2周和6周，在basal和luminal细胞中均观察到tdTomato表达，表明Dll1+细胞可产生两种谱系。谱系追踪也证实Dll1+细胞在怀孕第14.5天时可产生basal和luminal tdTomato⁺细胞。

五、乳腺巨噬细胞具有独特的分子特性，受Dll1+MaSCs调控

由于Notch信号参与细胞间信号转导，研究人员接下来想要确定MECs中的Dll1敲除是否影响乳腺中的特定基质细胞群。与野生型腺体相比，FACS分析显示Dll1^cKO乳腺中的F4/80⁺ 巨噬细胞减少且PDGFRα⁺ 成纤维细胞群有轻微减少，而CD31⁺内皮细胞没有观察到显著差异。免疫染色进一步证实在不同发育时间点Dll1^cKO 末端芽（TEBs）和导管中的F4/80⁺   巨噬细胞减少，并增加巨噬细胞的凋亡活性。3D体外共培养系统的乳腺切片和乳房球的免疫荧光分析证明Dll1+基底细胞位于F4/80⁺ 基质细胞附近，表明两个群体之间存在潜在的相互作用。接着他们又实验验证了乳腺巨噬细胞可诱导MaSC活性且P4-Dll1⁺ 细胞中干细胞活性的增强更显著于P4-Dll1^- 细胞，表明MaSCs依赖Dll1响应乳腺巨噬细胞。

六、去除巨噬细胞降低了Dll1+MaSCs的功能

为了研究MaSC微环境中巨噬细胞的Dll/Notch依赖性功能，研究人员首先使用氯膦酸盐脂质体（CL）去除Dlll-mCherry转基因小鼠中的巨噬细胞。巨噬细胞的消融减少了Dll1^mcherry+MaSC的数量并增加其凋亡，共移植实验表明MaSCs对巨噬细胞有依赖性。

他们还使用了两种其他的方法来体内消除巨噬细胞：1）Csf1r阻断抗体治疗和2）巨噬细胞Fas诱导的细胞凋亡（MaFIA）小鼠。WT小鼠的Csf1r阻断抗体治疗和MaFIA小鼠的AP20187治疗均显著减少巨噬细胞的数量，而不影响树突细胞和嗜中性粒细胞，并极大地阻断了Dll1⁺ P4细胞对乳腺再生的影响，他们还进一步使用两种体内模型来研究Notch信号在巨噬细胞中维持MaSC活性的重要性。这些研究表明Dll1⁺ MaSC通过Notch信号传导实现对乳腺巨噬细胞的功能依赖性。

七、Dll1调节相邻巨噬细胞中的Notch信号

他们随后利用体外共培养进一步研究巨噬细胞和Dll1⁺ MaSC之间的由Dll1介导的Notch信号传导之间的分子连接。研究结果表明Notch2和Notch3介导MaSCs和巨噬细胞之间的Dll1依赖性相互作用。为了检验在MaSC-巨噬细胞微环境内Dll1-Notch信号传导的功能重要性，研究人员再次使用了微球共培养分析。数据表明MaSCs和巨噬细胞之间的由Dll1介导的Notch信号通路对于支持MaSC的活性至关重要。

八、巨噬细胞Wnt配体的表达依赖Dll1

        最后，研究人员对从WT和Dll1^cKO乳腺分离的F4/80⁺ 巨噬细胞进行了转录组分析，发现在差异表达的基因中有三个Wnt配体：Wnt10A、Wnt16和Wnt3。qRT-PCR和免疫荧光分析共培养体系中的Wnt3、Wnt10a和Wnt16的表达进一步证实了巨噬细胞中Wnt配体表达依赖于Dll1-Notch2/3。此外，巨噬细胞刺激P4细胞的球形成活性可以在很大程度上被Wnt信号传导抑制剂Dkk1（Dickkopf-1）的存在所阻断。

        这些结果表明巨噬细胞对MaSC细胞群的调节很可能是由巨噬细胞响应Dll1-Notch信号进而增加Wnt配体表达分泌来介导的。

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JC评论 

一、Cinderella的评论：

       这是一篇中规中矩的发育学文献，论述翔实，采用了大量经典的研究手段，通过以往的经验及现有的数据分析来表明自己新颖的观点，值得我们学习。另外，乳腺癌干细胞是否也与微环境中的巨噬细胞存在此种cross-talk，值得进一步研究。

二、Lee的评论：

        这篇文章工作量很大、使用了多种基因敲除与敲入的工具小鼠、研究结果也非常漂亮。通读全文之后，我想到的几个问题是：这个乳腺干细胞与巨噬细胞互作的机制是否也适用于其它组织的成体干细胞？微环境中其它类型细胞以及其它信号通路到底起多大作用？最后，本文描述的应该属于一种正反馈机制（乳腺癌中可能亢进），体内必然存在某些负反馈机制来防止乳腺干细胞的过度自我更新（乳腺癌中可能存在相应的缺失）。