【原】乳腺癌异质性的遗传基础

孟凡凡，杨壹羚，付丽

天津医科大学肿瘤医院

国家临床医学研究中心

　　乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，在遗传及基因表型方面具有显著的多样性，这些差异表现在肿瘤细胞的增殖速度、侵袭能力、转移潜能、治疗效果及致病性突变等方面。乳腺癌异质性的遗传基础是什么？其来源又是什么？乳腺多样性的结构组成可能是乳腺癌异质性的基础，结合高通量测序技术的使用，将有助于人们研究乳腺癌细胞的起源，进而阐释乳腺癌的发生、发展过程。我们从正常乳腺上皮多样性的角度出发，总结了乳腺癌异质性的起源、遗传本质及其相关治疗与预后的研究进展。

　　一、正常乳腺发育与乳腺癌发生的关系

　　正常乳腺上皮的组成细胞包括管腔细胞与基底细胞。在组织学上，腺体由导管和小叶组成【1,2】。基底/肌上皮细胞群可能由多种不同功能的细胞组成，大部分的基底/肌上皮细胞不能过度生长，其中具有CD24/CD29/CD49f均高表达特征的细胞可能是乳腺组织干细胞（MASC）。

　　细胞动力学实验显示，在青春期的不同发展阶段，干细胞和前体细胞具有促使细胞形态形成的功能；而在成熟腺体中，MASC具有稳定和重塑导管内环境的功能【3】。人乳腺干细胞具有“双向分化潜能”，既能生成管腔细胞也能生成基底细胞。乳腺组织干细胞和前体细胞可能有助于形成乳腺癌干细胞。MASC在人类一生中都具有活性，这就意味着MASC能够长久容纳潜在的致癌缺陷或损伤，它比前体细胞（缺乏自我更新能力）、成熟细胞（无自我更新及增殖能力）更容易发生恶性转化【3】。MMTV-WNT1转基因小鼠模型实验显示：在MMTV-WNT1转基因小鼠腺体内，存在大量基底细胞及MASC亚群的增殖。携带MASC突变的肿瘤具有显著的瘤内异质性，同时包括管腔样和基底样型肿瘤细胞【4】。

　　乳腺癌的多样性可能是由肿瘤发生早期的“起始细胞”特征所决定的，随着起始细胞致癌性突变的积累及大量的克隆性增殖，逐渐演进形成肿瘤，而起始细胞的遗传学基础将决定肿瘤的生物学行为。需要注意的是，起始细胞与肿瘤干细胞概念接近但不相同。起始细胞是指携带致病性突变的正常细胞，即肿瘤细胞的前体细胞，而肿瘤干细胞是指那些维持致瘤性并促发转移的肿瘤细胞【5】。

　　二、瘤内异质性的研究

　　肿瘤异质性包括不同患者同类肿瘤之间存在差异性，以及同一肿瘤内癌细胞之间形态及功能上的差异性。乳腺癌瘤内异质性是指原发肿瘤与肿瘤转移灶中细胞亚克隆群在遗传、表型、生物学特性方面存在差异。细胞克隆亚群既可能存在空间异质性，也可能存在时间异质性【6,7】。空间异质性是指同一肿瘤不同区域的遗传性变异。时间异质性是指随着时间改变，原发肿瘤与继发肿瘤或远处复发肿瘤之间的异质性。

　　乳腺癌多样性与原癌基因的活化、抑癌基因的失活等肿瘤启动转化事件以及肿瘤起始细胞均有关，通过荧光激活细胞分选系统分析人乳腺上皮细胞证实了起始细胞分化特征决定肿瘤表型，例如具有上皮细胞黏附分子（EpCAM）阳性特征的细胞更易生成管腔型或基底型乳腺癌；具有CD10阳性特征的细胞可导致化生性乳腺癌与密封蛋白（claudin）低表达型乳腺癌【8】。在正常乳腺组织结构中，每类细胞都有其自身的信号通路、转录调节、表观遗传谱。近期的研究表明，不同阶段的起始细胞中，癌基因PIK3CAH1047R的表达产物会形成不同分化程度的乳腺癌，从而产生肿瘤多样性【9】。

　　乳腺癌干细胞是一种经过复杂的遗传突变与表观遗传改变的细胞，其自我更新、分化、凋亡均处于一定程度的非正常状态，这是导致肿瘤瘤内遗传异质性的重要原因。此外，在组织学层面上也存在瘤内异质性，例如化生性癌中可同时存在梭形细胞、鳞状细胞、大汗腺样细胞及软骨样细胞。因此，肿瘤有可能是由多种混合细胞组成的，包括不同比例的干细胞、前体细胞和已分化成熟的非增殖细胞【10】。

　　肿瘤微环境不仅在肿瘤异质性产生中起到关键性作用，且可以维持肿瘤干细胞的干性，并调控干性与非干性表型之间的转变。微环境中的肿瘤细胞与选择压力相关，例如治疗压力可导致肿瘤干细胞扩增。在成熟细胞及胚胎干细胞的研究中均证实了细胞的可塑性。细胞可塑性是指已分化细胞与去分化细胞之间的转变能力，最好的例子便是在胚胎期上皮间质转化（EMT）中可逆的过程【11】。已有研究对EMT及乳腺肿瘤干细胞之间的关系进行了详细阐述，认为在肿瘤干细胞与癌细胞之间存在功能上的可塑性。这就意味着，胚胎干细胞、成人干细胞、肿瘤干细胞均处于非静止状态，在一定条件下，通过肿瘤微环境的改变，癌细胞可以在干样细胞与非干样细胞之间转变。这就解释了肿瘤异质性产生的关键性问题，少量肿瘤干细胞在微环境的影响下通过自发突变导致亚克隆群的增殖【10】。

　　Laurinavicius等【12】通过数字图像分析评估Ki-67的表达，证实增殖性肿瘤的空间异质性可以作为乳腺癌独立预后因素。由于乳腺癌存在空间、时间异质性，单凭活检取材进行基因检测并不能完整的描绘出肿瘤的基因谱，因此有研究者认为肿瘤的体液活检可以从分子水平上动态地了解患者接受靶向药物治疗的情况，连续评估循环肿瘤细胞可以反映出肿瘤的时间、空间异质性【7】。随后Liang等【13】也认为检测血浆中游离DNA可以为患者的临床治疗阶段提供相对综合的基因组信息。通过比较100例乳腺癌患者肿瘤样本DNA与游离DNA中TP53、PIK3CA基因突变和EGFR、ERBB2基因扩增，发现游离DNA中一些特定的癌基因检测可以作为监测疾病进程、预测无进展生存期及提供靶向治疗的新方法【13】。

　　三、乳腺癌分子分型的遗传学基础

　　2000年Prat和Perou【14】在基因表达谱的基础上确定了乳腺癌5种固有分子亚型，包括管腔（Luminal）A型、管腔B型、HER2过表达型、基底细胞样型、正常乳腺样型；此外，还有研究将三阴性乳腺癌进行细化，分为密封蛋白低表达、IFN-rich、分子大汗腺癌亚型【15,16】。尽管这些分型数据是基于基因表达水平的研究，但是却体现了肿瘤的一些“固有”特性，高通量测序技术揭示了不同分子亚型肿瘤突变谱的差异【17】，支持这些亚型的起源可能不同，其遗传本质可能有差异。

　　1、管腔型乳腺癌的分子遗传基础：管腔A/B型乳腺癌的产生可能有2种模式：（1）细胞突变模式：MASC分化成管腔型干细胞，管腔干细胞进而生成腔上皮前体细胞，前体细胞最终生成腔上皮细胞。在这一进程的终末阶段，前体细胞和/或成熟的腔上皮细胞突变可能是管腔A/B型乳腺癌的来源。（2）肿瘤干细胞模式：腔上皮细胞直接由管腔型干细胞自身发生了突变，这类细胞可以表现出不同的突变谱，包括PI3K、MAP3K1、GATA3、FOXA1及TBX3基因发生突变【18】。

　　2、基底型乳腺癌的分子遗传基础：基底型乳腺癌的基因谱特点是TP53、BRCA1、MAGI3-AKT、RB、YAP/TAZ、SLUG发生基因突变，这种独特的突变谱与管腔型乳腺癌不同【19,20】。基底型乳腺癌很可能来源于管腔干细胞的突变，而非肌上皮直接突变引发，因为在这些肿瘤中肌上皮标志物表达下降。基底样乳腺癌中p53高突变可以导致DNA修复机制缺失，使肿瘤细胞继发突变。此外，反复继发突变、扩增或缺失也可能是基底样乳腺癌的遗传基础【21】。

　　3、HER2异质性乳腺癌的分子遗传基础：HER2阳性乳腺癌和管腔型乳腺癌的起始细胞可能相同，且二者进化相关【22】。HER2瘤内异质性表现为2种形式：扩增细胞成片状分布，扩增和非扩增细胞的混合分布【23】。研究表明在HER2异质性乳腺癌中HER2阳性部分与阴性部分某些基因表达存在差异，HER2阴性部分可能含有BRF2、DSN1基因扩增以及HER2体细胞性突变，而这些改变在HER2阳性部分是不存在的【24】。我们的研究也发现乳腺癌中HER2基因遗传异质性现象与HER2、ER蛋白表达显著相关，HER2异质性肿瘤的临床病理学特征更趋向于管腔型乳腺癌，这也进一步提示HER2异质性乳腺癌可能是由管腔型乳腺癌的继发突变而形成的【25】。

　　4、密封蛋白低表达型乳腺癌的分子遗传基础：密封蛋白低表达型乳腺癌具有三阴性乳腺癌的普遍特征，肿瘤细胞具有高浸润性、高度转移能力【26】。研究表明，该型乳腺癌密封蛋白3/4/7、上皮细胞钙黏蛋白和糖粘连蛋白表达降低，管腔型乳腺癌相关基因表达低，而淋巴细胞和内皮细胞标志物高表达【27】。基因表达谱显示：密封蛋白低表达型的乳腺癌细胞与肿瘤起始细胞及MASC具有相同的抗原表型，且密封蛋白低表达亚型乳腺癌的特点与基底细胞或MASC亚群相似【17,27,28】。

　　四、乳腺癌遗传异质性的研究方法

　　评价肿瘤异质性的方法在不断改进。通过基因拷贝数分析，可以评估肿瘤的纯度、细胞倍体，从而解释细胞亚克隆群畸变原因。通过高通量DNA测序技术对人乳腺癌全外显子组进行分析，可以得出畸变谱与特定肿瘤亚型之间的关系。此类技术发现乳腺癌中PIK3CA的突变率是25%、CCND1突变率是19%、FGFR1突变率是13%，此外还检测到AKT1、EGFR、MDM2、FGFR2、AKT2、IGF1R突变和MET高度扩增【29】。通过对乳腺癌患者DNA全外显子测序与正常基因组序列进行比较，确定了PIK3CA、TP53、AKT1、GATA3、MAP3K1、CBFB转录因子和RUNX1的反复突变【29】。

　　目前评价异质性的主要方法已改进为大规模平行测序、单分子测序和单细胞测序，与肿瘤测序相比，这种方法可以直接反映克隆细胞的基因型。Navin等【30】将大规模平行测序技术应用到单细胞测序上，确定了乳腺癌由不同的亚克隆群组成。单分子测序技术可排除由于PCR扩增引起的偏差，该技术比大规模平行测序更适合识别基因重组【31】。2015年Jonsson等【32】在MCF7和T47D乳腺癌细胞系中利用单分子测序技术检测雌激素受体的转录，揭示了雌激素受体直接靶向调节的转录因子是长基因间的非编码蛋白（LINC）RNA1016和00160，该转录因子与雌激素受体表达所产生的临床生物学行为相关。原位拓扑基因分型技术弥补了单细胞测序的不足，该技术可评估基因拷贝数变异及蛋白产物的表达和激活状态，并揭示肿瘤瘤内遗传异质性，联合荧光原位杂交和免疫组织化学可推断出肿瘤的生长模式和演变过程，描绘出乳腺癌瘤内异质性与病理之间的特点【33】。

　　五、乳腺癌异质性对治疗及预后的影响

　　瘤内异质性所产生的临床问题在于如何选择预后或治疗相关的分子指标，因为取材位置的不同所得到的结果可能会不同。临床资料也进一步说明由于瘤内异质性的存在，利用单个穿刺标本所获得的信息可能并不全面，甚至会误导治疗【34】。此外，研究表明对于治疗的反应程度不仅仅是根据肿瘤大小或者淋巴结转移状况决定的，还依赖于肿瘤的固有分子特征，这种分子特征可以通过分子生物学方法检测【35,36】。

　　基于肿瘤基因组的研究发现，转移性乳腺癌中存在大量的致癌性“驱动基因”突变，所以需要大规模的分子筛选，以此来确定这些突变与药物疗效的关系。分子层面的筛选对于药物个体化治疗意义重大，例如对于FGF通路改变的患者，可以靶向性的使用FGFR抑制剂；其另一重大意义在于对于携带多个“驱动基因”患者的联合靶向治疗，可以降低肿瘤耐药性。近来基于患者基因组水平差异，采用针对性的多靶点治疗已进入多中心临床试验阶段【37】。尽管该前瞻性研究尚缺乏随访数据，但是已经为“精准治疗”提供了良好的示范。

　　综上所述，管腔A型、管腔B型乳腺癌可能起源于管腔型干细胞或者成熟的管腔细胞，基底样型乳腺癌也起源于管腔干细胞、但携带大量遗传改变，而罕见的密封蛋白低表达型乳腺癌可能来源于单能的肌上皮干细胞或MASC。随着高通量技术的应用，深入研究乳腺癌的遗传基础，将有助于探讨肿瘤异质性的产生，进而有助于人们研究乳腺癌的发生、发展，达到真正意义的“精准”诊治。

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原文参见：中华病理学杂志. 2016;45(11):810-813.