4种脂蛋白相关磷脂酶A2活性测定试剂的性能评价

脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoproteinassociated phospholipase A2，Lp－PLA2)，是具有血管特异性的炎症标志物，2015年发布的《脂蛋白相关磷脂酶A2临床应用中国专家建议》(以下简称《建议》)推荐将Lp－PLA2检测用于冠心病及缺血性脑卒中的预测^[1]。

Lp－PLA2的检测主要包括通过各种免疫学方法，如：酶联免疫、化学发光、免疫层析、免疫荧光、胶乳增强等检测酶的质量，及通过速率法检测酶的活性。其中后者可直接应用于自动生化分析仪，操作简便，耗时短，故有利于临床推广。由于缺乏公认的参考物质和参考方法，故截止目前Lp－PLA2检测尚未实现标准化，这阻碍了该项目进一步扩大人群研究及广泛临床应用。本研究拟分析评估目前中国已上市的该类产品的基本性能及结果一致性，为后续临床应用提供参考。截至2017年7月，中国食品药品监督管理局(CFDA)批准注册连续监测法(或速率法)试剂共5家，本研究在市场中获取博源、德赛、恒晓、中元4家Lp－PLA2活性试剂(分别标为A、B、C、D)进行评价。

 材料与方法

一、材料

1．性能评估用血清：

收集2017年3至7月北京协和医院患者临床检测后剩余血清，骤制备不同Lp－PLA2活性的患者混合血清池。精密度验证血清1～4号血清池(标为P1、P2、P3、P4)的Lp－PLA2活性约为180、440、770、1 570 U/L，每份患者血清池各分装25份，－20 ℃冻存，试验前室温复融。分析选取低Lp－PLA2活性血清(约30 U/L)用于灵敏度试验。留取低(约100 U/L)、高(约1 900 U/L)Lp－PLA2活性血清进行线性范围评估。制备低、高两水平Lp－PLA2(标为L、H，分别为500、1 300 U/L)患者混合血清池，用于干扰试验。本研究已通过中国医学科学院北京协和医院伦理委员会审批(S－k336)。

2．比对血清：

收集北京协和医院2017年3至7月无溶血、黄疸的新鲜患者剩余血清标本214份，Lp－PLA2活性范围为29～1 564 U/L，用于4种Lp－PLA2活性试剂方法学比对及偏差评估。

3．参考区间验证：

收集2017年3至5月北京协和医院健康体检人群剩余血清标本，从中选取肝功、肾功、血脂均正常的表观健康人140名，其中男68名，年龄33.0(43.5～53.0) 岁；女72名，年龄32.3 (43.5～54.0) 岁，用于参考区间验证。

二、仪器与试剂

1．仪器：

Beckman AU5800全自动生化分析仪。

2．主要试剂：

A～D分别为苏州博源(170329和170119)、上海德赛(R1：22310、R2：22311、R3：22312)、长春恒晓(20170302)、重庆中元(Z170201) Lp－PLA2活性测定试剂及其配套校准品和质控品。干扰试剂盒：希森美康国际试剂株式会社(ZS6003)。

三、方法

1．精密度：

参考CLSI EP15－A^[2]方案，使用A～D四个系统分别检测P1～P4血清池样本及各制造商配套的低(标为QCL)、高(标为QCH)2个水平质控品，每天4次，连续测定5 d。计算各水平重复性及实验室内不精密度。

2．线性：

将低水平混合血清(L)、高水平混合血清(H)及生理盐水(S)，按照体积比0.3L∶0.7S、0.5L∶0.5S、0.7L∶0.3S、L、0.9L∶0.1H、0.8L∶0.2H、0.7L∶0.3H、0.6L∶0.4H、0.5L∶0.5H、0.4L∶0.6H、0.3L∶0.7H、0.2L∶0.8H、0.1L∶0.9H、H，配制成14个梯度的混合血清。从低到高各检测3次，记录结果。参考CLSI EP6－A^[3]文件，初步检查数据，剔除离群值，判断重复性，进行多元线性回归分析，并绘制散点图进行评价。

3．灵敏度：

参考CLSI EP17－A方案[4]，在同一批内连续测定去离子水(0水平)10次，低水平标本3次，记录反应吸光度值。按照以下公式计算定量限(limit of quantitation，LOQ)和检出限(limit of detection, LOD)。与试剂说明书提供的检测下限进行比较，高于试剂说明书提供的检测下限，则根据临床需要判断是否可接受。

4．干扰：

参考CLSI EP7－P[5]方案并进行部分调整后，制备成含有特定干扰物浓度(游离胆红素、结合胆红素、乳糜及血红蛋白)的高、低水平Lp－PLA2活性干扰血清。干扰血清中游离胆红素终浓度分别为650、487.5、325、162.5 μmol/L，结合胆红素终浓度分别为698、517.5、345、172.5μmol/L，血红蛋白终浓度分别为9.8、7.35、4.5、2.45 g/L，乳糜的终浓度分别为3 320、2 490、1 660、830 FTU。A～D分别测定混合血清各2次，求均值，计算添加干扰物和未添加干扰物血清测定值的百分偏差。以超过±10%为标准，判断是否存在干扰。

5．方法学比对：

分别用A～D检测214份血清标本Lp－PLA2活性，参考CLSI EP9－A2^[6]文件，以CFDA第一个注册试剂上海德赛公司B试剂测定结果作为X，A、C、D测定结果作为Y，绘制散点图，并进行相关分析。A、C、D分别与B进行简单线性回归分析，估计回归系数(slope)、截距(intercept)、决定系数R2及其95%可信区间。经与心内科副教授以上专家共同研究，将328、391、485 U/L设置为本研究医学决定水平，并分别计算在医学决定水平上的预期偏差。

6．参考区间初步评价：

参考CLSI C28－A2^[7]文件，为验证表观健康人Lp－PLA2酶活性与制造商标注的参考区间的一致性，统计分析了所有体检对象检测结果在制造商标注的参考区间内所占的百分比，评估参考人群测定值中是否有超过90% (126例)的测定值落在制造商标注的参考区间内。

四、统计学分析

应用MicrosoftExcel 2003、SPSS 20.0以及Medcalc软件进行统计学分析。采用K－S正态分布检查数据正态性，当P>0.05时，呈正态分布。非正态分布数据(年龄)，用中位数(四分位间距)表示。用Pearson相关分析，相关系数r>0.975表明样本检测浓度范围具有足够宽度。采用简单线性回归分析，决定系数R2≥0.95相关性良好，当P<0.05时，线性回归具有统计学意义。采用线性回归法估计医学决定水平上的预测偏差及其可信区间，预期偏差小于10%为可接受。

 结果

一、精密度评价

A～D各水平Lp－PLA2活性的重复性CV%分别为：0.5%～1.7%、0.7%～3.0%、0.9%～2.0%和0.5%～3.3%，实验室内不精密度CV%分别为：0.7%～2.9%、1.4%～3.2%、1.3%～1.9%和0.8%～4.1% (表1)。A、C、D实测精密度均小于厂商标注，B在低浓度水平的实验室内不精密度略高于厂商标注(总不精密度CV%<3.0%)，但均小于本实验室预先与临床医生共同评估的允许不精密度标准(<5%)，可满足临床应用。

表1 4种试剂精密度结果

二、线性评价

A～D的预期值和实测值散点图如图1、表2所示。A～D线性范围分别为：44 ～1 992 U/L、39 ～1 798U/L、13 ～540 U/L、75 ～1 717 U/L，回归决定系数R2在0.997～1.000之间，相关系数(r)在0.998～1.000之间。A～D预期值和实测值的平均百分偏差分别为：3.87%、1.76%、－6.48%、2.05%。

表2 线性评价预期值和实测值拟合的线性回归方程

图1 4种试剂线性评价结果

三、灵敏度评价

A～D的LOQ为5.85、20.39、0.62、12.64 U/L，LOD为1.17 、4.08 、0.12 、2.53 U/L均小于制造商标注检测下限，基本满足检测要求。

四、干扰评价

A、C说明书并未标明抗干扰能力。4种试剂在乳糜高达3320FTU时，均呈现良好的抗干扰能力。C在Lp－PLA2活性较低时受到胆红素，尤其是结合胆红素的明显负向干扰，其他试剂抗胆红素干扰能力达到制造商标注或临床常见严重黄疸水平。B、C在轻到中度溶血时即呈现了明显负干扰，尤以Lp－PLA2低活性水平时明显；D在明显溶血(Hb：4.5 g/L)时结果呈现正干扰，未达到制造商标注的5.0 g/L。结果见表3。

表3 4种Lp－PLA2干扰评价预期偏差

五、比对及偏差评估

图2为A、C、D与B检测214份血清标本Lp－PLA2活性结果直线回归图，各回归方程的决定系数R2均>0.975，相关系数(r)在0.989～0.998之间。A、C、D与B比对线性回归方程斜率(slope)及截距(intercept)分别为1.16 (95% CI: 1.16～1.17)和－4.1 (95% CI：－7.1～－1.1) (A vs B)、0.54 (95% CI：0.53～0.54)和－16.4(95% CI：－19.4～－12.6)(C vs B)、0.89 (95% CI：0.88～0.90)和149.0(95% CI：142.8～153.3)(D vs B)。A、C、D与B线性回归方程及其在医学决定水平处的预期偏差见表4。A、C、D与B在医学决定水平处的百分偏差在－51.45%～24.78%，其中A、D为正偏差，C为负偏差。

表4 A、C、D与B的214例Lp－PLA2活性检测结果在医学决定水平处预期偏差

图2 A、C、D与B试剂检测Lp－PLA2活性结果比对Passing－Babloke图

六、参考区间评价

A～D分别有131例(93.6%)、140例(100%)、82例(58.6%)、128例(91.4%)Lp－PLA2活性检测结果落在制造商标注的参考区间内。A、B、D符合参考区间验证标准，C参考区间验证结果与制造商标注差距较大。

讨论

目前各指南^{[8,9,10,11,12]}中仅中国《建议》中明确推荐测定血清Lp－PLA2质量。大部分Lp－PLA2与LDL－C结合，而Lp－PLA2质量测定仅检测的是与HDL－C结合的部分Lp－PLA2，此外，而Lp－PLA2活性可以反映催化酶的实际情况^[13,14]。精密度评价中，患者血清池P4的Lp－PLA2活性远大于C线性范围，故未对C进行此水平精密度验证。本研究验证了各制造商标注的线性范围且基本满足临床应用。C试剂线性上限低于其他试剂，主要是结果尚未实现一致化，整体测定结果偏低，而非线性范围窄。

由于Lp－PLA2既无参考测量程序，也无国际公认的有证参考物质，且Lp－PLA2活性是一个较新的检测项目，无经典方法作为参考标准，故本研究未进行正确度验证，仅比较了检测方法的一致性。方法学比对中，B是进口试剂，国际市场占有率较高，故将A、C、D与之进行比对。目前尚未有相关指南等提示Lp－PLA2的医学决定水平，但有文献提及Lp－PLA2与LDL－C及TG的相关性，通过与高年资心脏内科专科医生讨论，我们考虑利用美国胆固醇教育计划(NCEP)所提供的血脂医学决定水平，初步推导Lp－PLA2的医学决定水平。经统计214例患者及健康体检者的结果后发现，在多个血脂指标中，血清Lp－PLA2活性与LDL－C浓度相关性最显著(r＝0.545，P<0.001)，故将LDL－C的医学决定水平(2.07、2.59、3.37mmol/L)所对应的Lp－PLA2活性(328、391、485U/L)初步设定为医学决定水平。比对中A、C、D与B均呈现了良好的相关，但医学决定水平处的偏差却非常显著，检验结果一致性不能够满足临床应用。但良好的相关性提示，可以通过研制标准物质等方式改善检验结果一致性。

本实验中加入血红蛋白量较大，远超出临床常见溶血时的血红蛋白浓度，主要是为验证B制造商标注的性能。另外血红蛋白加入试验也不能完全反映溶血时干扰的全貌，因为细胞内外酶活性的差别也有可能影响检测结果，有待于进一步探索。

C参考区间与制造商标注不符，可能与建立参考区间时的参考人群选择有关。有文献报道Lp－PLA2水平与种族有关^[15]；另外其虽不受饮食和昼夜节律影响，但与性别相关，绝经前女性Lp－PLA2低于男性，可能与雌激素有关^[16]。研究证实，Lp－PLA2应该按照年龄和种族进行危险分层^[15]。因此，建议各实验室应建立适合本实验室的参考区间。

总之，为了使Lp－PLA2在临床更广泛使用，在保证检测方法基本性能的前提下，首要解决的是检验结果一致化和标准化问题，这也是未来临床研究结果可以进一步荟萃并上升为共识、指南的基础。本室也将继续研究Lp－PLA2一致化问题。