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血清叶酸、维生素B12和铁及其相关物测定 IDA和MA以及相关性贫血是临床上最常见的贫血，都需要检测血清叶酸、维生素B12和铁及其相关物质，进行诊断与鉴别诊断。
一、血清叶酸、维生素B12及其相关检查 当怀疑维生素B12和叶酸缺乏时，一个共同的诊断出发点是检测血清维生素浓度，最好是在患者空腹时检查。一般，叶酸或维生素B12的减低表示机体摄入减少或吸收障碍或需求量明显（图21），但少数情况检查的结果解释需要认真（表7）。如血清叶酸不是持续低于3 ng/ml并不能可靠地反映人体对维生素的摄入量，由于红细胞形成时叶酸就被包在细胞内，直到衰老而被破坏，因此测定平均红细胞叶酸水平也不能很好反映最近的膳食叶酸相对减少的状态。此外，红细胞叶酸可因维生素B12缺乏而减少，可以导致不适当的判断。对血清维生素B12水平的解释也有若干问题，如在叶酸缺乏病例中血清维生素B12水平可以下降。参考区间（化学发光免疫分析法），血清叶酸为5.5~23.4nmol/L，红细胞叶酸为340~1020nmol/L，血清维生素B12为172~674pmol/L。 图21 MA临床和形态学特征与血清叶酸或维生素B12缺乏的关系 *指缺乏所致的相对性为主。随着生活和医疗水平的提高，维生素B12缺乏所致的MA日益增多，并具有一定的临床与形态学特征。 表7 叶酸和维生素B12缺乏的实验室检查
已在前述，贫血中有缺铁的和铁增加的类型，对于这些贫血患者，检查血清铁及相关指标有重要的评判意义，也是早期发现缺铁的实验室检查的主要项目。
1．血清铁蛋白 血清铁蛋白（SF）是体内铁贮存的一种形式，在血夜中微量存在。SF与骨髓贮存铁有良好的正比关系，是体内铁贮存可靠的指标。当体内铁负荷或过多时增加，铁减少时降低（表8）。因此，检查SF可以反映体内铁的贮存情况，用于评估病人体内铁缺乏的一个重要指标；除非炎症不依赖贮存铁量刺激铁蛋白的合成或肝细胞损伤致铁蛋白释放而增加时。在无这些并发症的情况下，SF低于20μg/L提示铁缺乏，有并发症时的临界值约为100μg/L，因此无并发症的缺铁具有诊断意义。SF参考区间为成年男性18~330μg/L，成年女性9~200μg/L，儿童8~101μg/L（平均34μg/L）。 表8 贫血患者SF、SI和TS的浓度变化△
SI为血清铁，SF为血清铁蛋白，TS为运铁蛋白饱和度，TFR为运铁蛋白受体，UIBC为未饱和铁结合力，TIBC为总铁结合力；△SF与TIBC成反比，与TS成正比；*者示有缺铁 2．血清铁 血清铁（SI）即血浆铁，占总铁量的0.05%~0.1%，是血浆中与约1/3的运铁蛋白（transferrin，TF，又名转铁蛋白、β1球蛋白）结合的铁量，直接反映体内运输铁含量的指标。参考区间为男性0.76~1.58mg/L，女性为0.60~1.73mg/L。当铁丢失大于摄入时或摄入小于机体需要时，在骨髓可染铁缺乏的同时，SI开始下降。 3．血清运铁蛋白 血清运铁蛋白（TF） 是正常血清中的一种蛋白成分，为β球蛋白中能和铁结合的一种糖蛋白，主要功能是转运铁，调节铁的吸收，防止铁中毒，并有抗细菌和抗病毒的功能。当机体受到急性感染或慢性感染时，血清TF浓度可以降低，肾病综合征、肝硬化、恶性肿瘤、溶血性贫血、营养不良时也可以出现减低；IDA、妊娠后期血清TF含量增高。参考区间为28.6～51.9μmol/L或2.65~4.30mg/L（免疫比浊法）。
4．血清运铁蛋白受体 运铁蛋白受体（TFR）是位于细胞表面的跨膜糖蛋白，介导含铁的铁蛋白从细胞外进入细胞内，血清TFR是细胞（主要是早期有核红细胞）表面受蛋白水解而衍生的可溶性形式，即可溶性TFR（sTFR），并与转铁蛋白以复合物的形式存在。sTFR诊断IDA（浓度增高）有较强的敏感性和特异性，较少受炎症及恶性疾病的影响。但需要注意的是在初期缺铁，sTFR增加不明显，随着贮存铁及贫血程度的加重，浓度才会明显升高。sTFR降低，见于AA和肾功能衰竭等慢性病性贫血。此外，sTFR可用于观察某些疾病（肿瘤）骨髓造血和化疗后骨髓受抑（降低）的程度和恢复状态（升高），骨髓移植后造血重建情况（升高示佳），以及用EPO治疗贫血时的监测指标，根据sTFR水平观察疗效并调整剂量。
5．运铁蛋白饱和度 运铁蛋白饱和度（TS）又称血浆铁饱和度，等于SI/TIBC（血浆总铁结合力）。参考区间20%~40%。>20%~25%可以排除缺铁，IDA常<>，铁负荷性增加时常>55%。TF与SI、UIBC、TIBC的关系见图22。 图22 TF与SI、UIBC、TIBC和TS的关系 *由于血浆中的极微量铁还与其他蛋白结合，故血浆TIBC仅为相等于血浆中的TF
6．其他指标 （1）血浆未饱和铁结合力：血浆未饱和铁结合力（UIBC），通常情况下，血浆中TF的2/3不与铁结合，这一不结合的TF量即为UIBC，它相等于TIBC-SI。参考区间为2mg/L。
（2）血浆总铁结合力：血浆总铁结合力（TIBC），是指100ml或1000ml血清中全部TF能与铁结合而表示的总量，即相等于SI+UIBC。参考区间，男性为249~387μg/dl，女性为204~429μg/dl，基本上近于或相等于血浆TF水平。SI、UIBC和TIBC三者合称运铁参数，意义见表15。
（3）血浆铁消失率：血浆铁消失率（PID），又称血浆放射性铁半衰期，是给患者注射加入在体外血浆中与TF结合的59Fe后，检测体内放射性Fe活性从血浆中消失的半衰期（T 1/2），即血浆铁廓清率。这一消失速度也是血浆中铁的流速，可以了解体内铁的动态。参考区间为51~108分钟（76.6±15.8分钟）。当体内铁利用增加时PID减低，利用减少时增加。
（4）血浆铁转换率：血浆铁转换率（PIT），为单位时间内的血浆流量，示血浆铁每分钟有多少被输送到组织去。计算公式：PIT（mg铁/dl全血/d=SI（μg/dl）×（100-Hct）/PID（分钟）×100，参考区间为0.7mg/dl全血/d；或者PIT（mg/kg/d）=SI（μg/dl）×循环血浆量（ml）×24×0.693/T 1/2（h）/体重，参考区间为0.693~2.28mg/kg/d（1.30±0.37mg/kg/d）或0.46~0.78mg/kg/d；
（5）红细胞铁利用率：红细胞铁利用率（RCU），指在一定的时间内，为给予的59Fe量与外周血中最终出现于红细胞中59Fe量的比率，表示铁的百分之几用于血红蛋白合成。参考区间为80~90%/7~8d或90%~95%/15~20d。
（6）红细胞铁交换率：红细胞铁交换率（RIT or RCIT），为PIT×RCU，表示理论上在单位时间内用于血红蛋白合成的铁量，即红系有效造血的能力。参考区间为0.644±0.193mg/kg/d或15~30mg/d。
（7）59Fe显性聚集部位：是用定向闪烁测量持续标记肝、脾、骨髓和心脏的59Fe活性，指59Fe进入体内在脏器中的分布情况。正常情况，在注射59Fe后，骨髓部位铁活性立即上升至最高，次日下降，表明有核红细胞成熟时59Fe被用于合成血红蛋白。上述几项指标的意义见表9。这些指标在临床上虽少使用，但对进一步了解或研究铁的代谢和铁的动力学有着重要意义。
（8）红细胞游离原卟啉：当铁缺乏或铁不能被利用时，血红素合成影响，可以导致红细胞游离原卟啉（FEP）增高，间接反映铁的缺乏，其灵敏性仅次于SF和TF，但特异性佳，因为血红素合成的最后一步是铁进入原卟啉环，递给红细胞的铁不足，FEP水平就升高，表示血红素合成障碍，故可以将FEP看为缺铁性红细胞生成（缺铁形态红细胞）的一个指标。参考区间，男性为0.097~0.90μmol/L全血，女性为0.144~0.90μmol/L（荧光分析方法）。 表9 贫血的59Fe动力学指标
溶血检查 血液和骨髓检查是贫血的常规项目，与Ret、血清胆红素和乳酸脱氢酶等检查一起是初步评判有无溶血或HA的过筛试验。通常，在确认溶血存在的证据（溶血的共同特点是红细胞寿命缩短、红细胞破坏过多、骨髓代偿性造血亢进并存）的先后或同时需要进一步检查确认溶血的部位，即血管内溶血还是血管外溶血和（或）HA的类型（病因）。下面介绍的溶血检查是查明溶血部位、类型的实验室检查，其中多是确诊项目。
一、反映血管内溶血的检查 血管内和血管外溶血性贫血的主要类型见表10，在选择性检查前应有恰当的评估。 表10 血管内溶血性贫血与血管外溶血性贫血的类型
1．糖水试验 糖水试验又称蔗糖溶血试验。PNH红细胞存在膜结构异常，有补体参与下容易遭受破坏（溶血）。糖水试验是利用低离子浓度蔗糖溶液，经过温育激活C3补体系统使有膜结构异常的红细胞发生溶血。糖水试验的灵敏性较高，在临床上作为PNH的一种过筛试验，尤其适用于原因不明的HA、伴缺铁的再生不良性贫血等病人。参考值为阴性。
2．Ham 试验 Ham试验（Ham test）又称酸化血清溶血试验或酸溶血试验。PNH红细胞膜结构缺陷对酸性环境更为敏感，故在实验条件pH 6.4~6.5并温育的情况下，更易遭激活的补体的破坏（溶血）。酸溶血试验的特异性比糖水试验强，在开展红细胞膜缺陷的分子检测前，临床上多依赖酸溶血试验确诊PNH。参考值为阴性。
3．尿隐血和含铁血黄素试验 检测这两个指标可以反映血管内溶血的存在及血管内溶血的程度。当血中游离血红蛋白增加（一般>1300mg/L）超过了结合珠蛋白（Hp）的结合能力（检测血浆Hp含量降低）和肾小管重吸收能力（肾阈）时便在尿中出现（游离）血红蛋白，即血红蛋白尿。此时，作尿隐血试验阳性，而尿沉渣镜检红细胞阴性。血中游离血红蛋白在经过肾小管重吸收时，在肾小管上皮细胞内被分解为含铁血黄素并沉积于肾小管上皮细胞，当含铁的上皮细胞脱落于尿液中即形成含铁血黄素尿。此时用尿含铁血黄素试验检查为阳性。
尿含铁血黄素试验又称Rous试验，是了解有无慢性血管内溶血，如PNH（尤其是急性发作时）和其他血管内溶血性疾病的一个指标。尿中含铁血黄素为含铁质的棕色色素（不稳定铁蛋白聚合体），其高铁离子（Fe+++）与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下生产蓝色的亚铁氰化钾普鲁士蓝沉淀，在镜下为分散或成团的蓝色闪光颗粒，直径1~3μm，或位于在上皮细胞内。在上皮细胞中检出含铁血黄素颗粒的意义比细胞外为大，因铁染色中人为的蓝色沉淀物不出现于细胞内。反复发作的血管内溶血患者中，本试验多为阳性。
4．流式血细胞CD55和CD59检查 流式细胞免疫表型检查是一种快速对单细胞进行分析和分选的技术，在贫血中主要用于红细胞膜原发性和继发性异常病症的诊断，被用来确诊的新指标。原发性红细胞膜异常症，有PNH、先天性CD55缺乏症与CD59缺乏症，还有遗传的球形红细胞增多症、口形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症以及一些酶的缺陷症；继发性红细胞膜异常症有氧化性损伤所致的膜异常、免疫异常产生自身抗体与红细胞结合的溶血性贫血以及肝病等原因所致者。
在原发性膜缺陷中，PNH是临床上最常见的贫血，是由于异常细胞的膜缺乏GPI，导致有锚连接膜表面的蛋白丢失。这一丢失的主要蛋白即为CD55（C3转化酶衰变加速因子）和CD59（反应性溶血膜抑制物），而先天性CD55和先天性CD59缺乏症，都为单一蛋白缺乏，与PNH不同。因此，流式免疫表型检查PNH是临床上应用和诊断的贫血最多的类型。参考区间为红细胞及粒细胞的CD55、CD59均表现单一的阳性峰，低表达群细胞（不表达CD55和CD59细胞）<>；外周血中CD55和CD59阴性细胞全部<>，而PNH常>10%。
5．气单胞菌溶素变异体检查 PNH是由于造血干细胞基因突变导致GPI合成障碍而造成血细胞膜表面锚蛋白缺失，红细胞则因表面缺乏补体调节蛋白而对补体敏感。检查中利用气单胞菌溶素（serolysin）直接连接于GPI锚蛋白，而GPI阴性的PNH患者细胞对气单胞菌溶素抵抗，可以通过流式细胞仪对以荧光素标记气单胞菌溶素变异体进行识别，区分出GPI阳性和阴性细胞，诊断PNH，尤其是对CD55和CD59检查还不能确诊的病例。 以上检查方法的性能见表11。 表11 几种检查PNH方法的性能
*指基层医院实验室尚不能开展
6．冷溶血试验 冷溶血试验，是用于诊断冷溶血素型自身免疫性溶血性贫血，即阵发性寒冷性血红蛋白尿（PCH）的常规方法。PCH是一种自身免疫性疾病，病人产生一种冷反应性自身抗体，即D-L抗体，属IgG型，在37℃下不能与红细胞牢固结合，但当温度降至20℃并有补体存在情况下，即能与红细胞发生牢固结合，当温度升至37℃时由于补体反应使红细胞膜发生空洞而溶血。由于实验中先要降低标本温度与冷抗体结合，随后又要升高温度使红细胞溶血，故本试验又称为冷热溶血试验。试验中，以血型相同的正常人红细胞加入新鲜的豚鼠血清（供给补体）和病人血清（抗体），以正常血清为对照，先置于冰水中（0～4℃）约30分钟，再置于37℃水温中2小时。如果发生溶血，表示D-L抗体存在，正常对照不溶血。D-L抗体的效价一般不很高。参考值为阴性。某些病毒感染如麻疹、流行性腮腺炎、水豆、传染性单核细胞增多症也可以呈阳性反应。
7．变性珠蛋白小体检查 变性珠蛋白小体即Heinz小体，为变性的血红蛋白颗粒，一般附着于红细胞膜上或细胞边缘，为圆形或多角形的蓝紫色小体，直径0.3~2μm，多数一个细胞1~2个。正常红细胞不含变性珠蛋白小体，G-6-PD缺乏症（蚕豆病、伯胺喹啉型药物性溶血性贫血）和不稳定血红蛋白病患者在使用氧化性药物后发生的溶血时，可以形成变性珠蛋白小体。因此，检出这一小体对G-6-PD缺乏症和不稳定血红蛋白病有诊断价值。
检测变性珠蛋白小体需要碱性染料（如甲紫、乙酰苯肼、煌焦油蓝）染色红细胞而显现。红细胞缺乏G-6-PD时，由于还原型辅酶II（NADPH）生成减少，红细胞内GSH减少（代谢障碍）而使血红蛋白变得不稳定（图1-8），如受到氧化性药物的影响，血红蛋白即发生变性；不稳定血红蛋白病由于血红蛋白分子中的某个氨基酸发生替换或缺失，使血红蛋白分子不稳定而变得易被氧化。将患者血液体外经过染色和温育，易使变性珠蛋白形成变性珠蛋白小体。8．高铁血红蛋白还原试验 本实验作为G-6-PD缺乏症所致溶血性贫血的一种过筛试验。红细胞内G-6-PD在磷酸己糖旁路代谢中的作用是使6-磷酸葡萄糖转变成6-磷酸葡萄糖酸，同时使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）转换成NADPH。NADPH则能使红细胞内的氧化型谷胱甘肽（GSSG）转变为还原型谷胱甘肽（GSH），并使高铁血红蛋白（HbFe+++）还原为二价铁血红蛋白（HbFe++）。在检查中，以亚硝酸钠试剂使HbFe++氧化为HbFe+++，以美兰递氢作用加强磷酸己糖旁路糖代谢。如果红细胞G-6-PD含量正常，则有足量的NADPH产生，使HbFe+++和GSSG都很快发生还原反应；如果缺乏G-6-PD则由于NADPH产生减少使之HbFe+++和GSSG还原能力下降。因此，可以高铁血红蛋白的还原率来反映NADPH功能，进而测知是否存在G-6-PD的缺乏。定量方法参考区间，外周血还原率在75%（脐带血77%）以上，74%~31%为G-6-PD中度缺乏（杂合子），<>（脐带血<>）为重G-6-PD度缺乏（纯合子）；定性方法参考值为阴性。
9．血中游离血红蛋白和结合珠蛋白测定 这两个指标都是直接反映血管内溶血及其程度的敏感指标。当溶血发生时，血浆游离血红蛋白首先升高，与之发生结合的是血浆结合珠蛋白（Hp）。此时检测血浆游离血红蛋白增高和Hp降低，后者系过高的游离血红蛋白超过了Hp的结合量。健康人血浆中含有微量的血浆游离血红蛋白，参考区间为40mg/L以下（比色法），血管内溶血明显存在时其浓度常在60mg/L以上。血清Hp参考区间为0.5~1.5g/L（电泳比色法），Hp<0.25g>对溶血性贫血具有高度特异性。除了血管内溶血外，血管外溶血存在（如温抗体型AIHA和地中海性贫血）时也可见Hp降低，且其减少的程度常与病情的严重性相一致。在电泳时，若在其位置前可以出现一条高铁血红素白蛋白区带时为血管内溶血，无此区带表明为血管外溶血。Hp由肝脏产生，故肝病时可以减低，此外遗传性缺乏症和传染性单核细胞增多症等情况下也可以降低；部分感染、结核、肿瘤和自身免疫性疾病可以增加。
10．血中高铁血红素白蛋白和血红素结合蛋白检测 当血过量的游离血红蛋白不被Hp结合而剩余时，多被氧化为高铁血红蛋白，进而被分解成高铁血红素和珠蛋白。产生的高铁血红素与血浆白蛋白结合，形成高铁血红素白蛋白。由于高铁血红素白蛋白在血中的停留时间长（持续数日）。因此，高铁血红素白蛋白（参考区间为阴性）的出现表示Hp被消耗后的严重血管内溶血。过量游离血红蛋白产生的血红素即与血红素结合蛋白（Hx）结合，因此血中Hx水平降低也可以反映血管内溶血的严重性。
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