前情提要
9月18日和25日，我们分别在和中，就RNAscope在肿瘤免疫微环境中的优势以及TME研究实例进行了详细的分析。本期将继续肿瘤免疫微环境的主题，说一说该方法在临床科研药厂的应用实例总结。
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肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）是肿瘤细胞存在的周边环境，包括肿瘤周围的血管，免疫细胞，成纤维细胞，骨髓来源的炎症细胞，淋巴细胞，信号分子和细胞外基质（ECM）。肿瘤细胞可以通过释放细胞外信号影响周边的微环境，促进肿瘤血管增生和抑制周边的免疫细胞，而肿瘤微环境中的免疫细胞及因子又可以影响肿瘤细胞的生长（见下图）。
肿瘤微环境示意图
传统的肿瘤治疗方法例如化疗法和放疗法都将肿瘤作为一个整体，通过使用化合物或者放射物对其进行杀伤。近年来，以免疫治疗为首的新兴肿瘤治疗方法则是深入肿瘤组织内部对其进行剖析，研究肿瘤细胞与其周边微环境间的相互作用，了解为什么肿瘤细胞作为非正常细胞能够逃脱机体的免疫监控迅速大量生长，探究肿瘤微环境中的各种细胞成分的分布与变化对肿瘤细胞的作用，及其潜在治疗开发前景。
有趣的是，随着研究的深入，人们发现肿瘤细胞表面表达的免疫监测点相关蛋白的高低，肿瘤细胞周边以及肿瘤基质中哪类免疫细胞浸润分布（例如杀伤性T细胞或是抑制性T细胞，血液来源淋巴细胞或是骨髓来源单核细胞），肿瘤周边分布浸润细胞分泌的细胞因子类型（例如IFNγ, TNFα等）都与肿瘤的生长，抑制或药物治疗存在着紧密关系。也就是说肿瘤内部各分子细胞的空间分布信息在免疫治疗等他新兴肿瘤治疗方法（例如靶向治疗）中必不可少。这些发现使得对于肿瘤的原位检测变得至关重要。
为了揭示这些肿瘤内部的空间信息，针对蛋白原位检测的免疫组化方法和针对RNA水平的RNAscope技术成为两大可选方法。RNAscope公众号平台将连续三周（9月18日、9月25日以及10月9日）分别就
1）RNAscope原位检测方法在肿瘤微环境中的检测优势；
2）非小细胞肺癌和卵巢癌中针对肿瘤与肿瘤微环境的研究实例；
3）该类方法在免疫治疗药物研发和肿瘤微环境科研领域中的应用；
进行分析，探讨RNAscope方法在肿瘤微环境研究中的应用前景。敬请关注！
本篇就该类方法在免疫治疗药物研发和肿瘤微环境科研领域中的应用进行分析，阐述RNAscope在肿瘤以及肿瘤微环境研究中的独特优势。
一、RNAscope原位检测方法在肿瘤免疫监测点研究中的应用
肿瘤细胞表面通过表达免疫监测点配体例如PD-L1与肿瘤微环境中的免疫细胞表达免疫监测点例如PD-1结合，从而抑制免疫细胞对其进行攻击。目前若干个PD-1/PD-L1抗体药物已获得美国FDA批准用于黑色素瘤以及非小细胞肺癌的治疗，而使用这些药物治疗其他类型肿瘤例如膀胱癌，胃癌，头颈癌等也多处于临床试验阶段。在这些PD-1/PD-L1的肿瘤生物学研究以及药物的研发过程中，多篇报道使用了RNAscope技术，对肿瘤细胞内以及肿瘤微环境（TME）中的PD-1和PD-L1的空间分布情况进行检测。例如Kurt A. Schalper等人在乳腺癌的研究中发现60%乳腺癌表达PD-L1 mRNA，并与肿瘤浸润淋巴细胞增加和无瘤存活相关[1]。Shafei Wu等人在肺腺癌中使用RNAscope和免疫组化的方法评估PD-L1分布与临床病理特征的相关性[2]，发现PD-L1在男性吸烟肺腺癌中过表达，且为手术后不良预后的指征；Ziming Du等人在间变性脑膜瘤中使用RNAscope和IHC方法探测PD-1的分布以及周围淋巴细胞的浸润情况[3]，发现低分化脑膜瘤内存在免疫抑制微环境伴随增多的免疫调节细胞和PD-L1分布；Yu Mei在脑垂体瘤内通过RNAscope方法检测到PD-L1分布并伴随肿瘤淋巴细胞浸润[4]，提示免疫治疗在脑垂体瘤内的应用前景；Yunqin Lee等人使用RNAscope 2.5 HD-duplex在头颈鳞癌内观察CD44与PD-L1的分布情况，发现CD44阳性细胞选择性表达的PD-L1。揭示了CD44阳性肿瘤浸润细胞选择性逃避机体的免疫反应，提示PD-1靶向治疗在头颈部鳞癌中的治疗前景[5]；Jiajia Yuan等人在胃癌中使用免疫组化和RNAscope方法检测PD-L1的分布以判断其与胃癌的相关性[6]，发现肠型胃癌中PD-L1的转录高于弥漫型胃癌。Xiaohua Shi等人在非小细胞肺癌的研究中使用RNAscope与免疫组化法检测PD-L1的分布情况，证实PD-L1的表达与肿瘤的淋巴血管浸润有相关性[7]。
由于免疫组化方法和RNAscope方法都可以在原位对肿瘤细胞以及周边TME细胞内的PD-1/PD-L1进行定位，人们更加关心两种方法在原位检测中的相关性以及有何差异。美国科罗拉多大学安舒茨医学分校为首的科研人员对比了小细胞肺癌中使用FDA批准的Ventana的SP142的 PD-L1抗体，Dako的clone 28-8的PD-L1抗体获得的免疫组化结果与使用RNAscope检测的PD-L1 mRNA结果。使用Dako28-8抗体在肿瘤细胞内检测到19.4%的PD-L1阳性表达信号，而SP142在同一组样本中检测到的PD-L1阳性率为14.7%。两者间的差异与SP12抗体结合PD-L1的细胞内段而Dako 28-8抗体结合细胞外段有一定的关联。RNAscope检测的PD-L1 mRNA信号阳性率为15.5%，结果与免疫组化检测的阳性率相似。统计学结果显示在小细胞肺癌与非小细胞肺癌（另一项研究中）RNAscope检测到的PD-L1 mRNA信号与免疫组化检测结果有显著相关性。有趣的是，在使用PD-L1与临床结果进行比较时，免疫组化结果未检测到PD-L1蛋白与临床数据有显著相关性，但RNAscope检测到的PD-L1 mRNA信号却发现与小细胞肺癌病人的年龄存在显著相关性（P=0.0006）[8]。在另一项乳腺癌的临床实验中，RNAscope检测到的PD-L1 mRNA表达与浸润性淋巴细胞（TILs）相关，与UVA和MVAs的无瘤生存期相关，提示了PD-L1的mRNA最为预后诊断的潜在价值[1]。正是由于RNAscope技术检测的稳定性以及与免疫检测的相关性，Merck & Co在开发PD-L1免疫检测用抗体 clone 22C3时为了验证抗体在组织和细胞中的分布准确性，使用RNAscope方法的结果作为参照[9]。
除PD-L1这一广泛研究的免疫检测点外，美国默克公司和University of Pennsylvania以Jennifer H. Yearley为首的团队在接受pembrolizumab治疗（抗PD1治疗）的头颈部鳞癌病人中，使用开发阶段的PD-L2抗体进行免疫组化法和RNAscope方法检测PD-L2，分析PD-L2对治疗的影响。结果发现PD-L2可以独立成为pembrolizumab无进展生存期（progression-free survival）的预测指标，且PD-L2阳性病人比PD-L2阴性病人具有更加长的无进展生存期和整体存活期（overall survival），提示PD-1抗体治疗过程中同时阻断PD-L1和PD-L2的病人有更好的临床治疗效果[10]。美国克利夫兰医学中心的 Zhen Wang和James R. Cook在原发性纵膈大B细胞淋巴瘤（PMLBCL）与弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的鉴别诊断中，根据前者（PMLBCL）由于基因重排导致过表达PD-L1和PD-L2，从而使用RNAscope（RISH）的方法来检测PD-L2 mRNA水平过表达帮助鉴别准断PMLBCL（目前无商业化的PD-L2抗体）[11]。
二、RNAscope原位检测方法应用于肿瘤微环境中细胞因子/趋化因子的检测
胰腺癌
Lucia De Monte等人在研究胰腺导管腺癌（PDAC）的过程中，发现2型T辅助细胞（Th2）淋巴结浸润与病人预后差有关。在病人淋巴结内，表达IL-4的嗜碱性粒细胞与Th2/Th1细胞比例有显著相关性，而嗜碱性细胞自身也可作为评判手术后预后的独立指标。在对嗜碱性粒细胞是否特异性表达IL-4的研究过程中，由于IL-4属于分泌型因子，无法通过免疫组化的方法进行原位准确检测，故该研究团队使用了RNAscope确定了嗜碱性粒细胞特异性表达IL-4（见下图）[12];
在胰腺癌发生机制的研究中，Geou-Yarh Liou等人发现白介素13（IL-13）可以转换炎症巨噬细胞成为Ym1阳性选择性活化巨噬细胞。Ym1阳性巨噬细胞释放的因子，例如IL-1ra和CCL2可以驱动胰腺纤维化并具有致瘤性。由于该研究中涉及的IL-13，CCL2，IL-1ra都属于分泌型蛋白因子，很难通过免疫组化的方法在组织内进行定位，因而该团队使用了RNAscope 2.5 HD assay-RED试剂盒检测这些分泌型因子的mRNA在组织中的分布，为巨噬细胞在胰腺癌发展中的作用提供了原位检测数据[13]。
乳腺癌
在评估乳腺癌存活指标的一项研究中，Elin Sjo¨ berg等人通过RNAscope方法分析乳腺癌细胞和基质内CXCL14的mRNA转录水平（见下图），发现肿瘤基质内高表达CXCL14与ER阴性乳腺癌，三阴性乳腺癌以及基底细胞样乳腺癌的存活时间缩短有显著相关性（见下图）[14]。
前列腺癌
已知IL6在前列腺原位癌和转移瘤中与肿瘤的发展有紧密关系。Shu-Han Yu等人通过RNAscope方法试图明确前列腺癌中IL6的分泌细胞类型。发现IL6的mRNA只在肿瘤基质内的内皮细胞和巨噬细胞内转录，以及在骨转移瘤中的血管内皮细胞内转录。明确了前列腺中的IL6是通过旁分泌而非自分泌形式参与疾病的进展（下图中的棕色信号点为IL6的mRNA）[15]。
当使用针对肿瘤细胞异常信号通路的激酶抑制剂对前列腺转移癌进行治疗时，cabozantinib（VEGFR抑制剂）表现出快速清除低分化小鼠前列腺癌的效果。通过使用 RNAscope对接受cabozantinib处理的肿瘤组织进行原位检测发现，这一效果主要是由于该药物诱导中性粒细胞在肿瘤内的持续浸润并分泌CXCL12细胞因子（见下图），引发中性粒细胞免疫反应杀伤肿瘤细胞[16]。
淋巴瘤
间变性大细胞淋巴瘤是非霍奇金氏淋巴瘤（ALCL）中的常见类型，具有ALK重排阳性和阴性两种亚型。在Xiaoming Xing等人的研究中，发现在ALK阴性ALCL中过表达CCR8。由于缺乏CCR8抗体，该研究使用了RNAscope方法，发现CCR8在ALCL伴随DUSP22重排的非ALK病人中高表达，而与真皮浸润无明确相关性。下图为CD30阳性的T细胞内（B）RNAscope检测CCR8 mRNA（C）的结果[17]。
结肠癌
在针对结肠癌转移基质的研究中，Luka Stanisavljević等人通过RNAscope方法和免疫组化法证实CXCL12和CXCL12-CXCR4的转录表达是独立判断TNMIII结肠癌五年无病生存期的独立预后指标。下图中c-f中的棕色信号点为RNAcope检测到的CXCR4（c-d）和CXCL12（e-f）的mRNA信号[18]。
一直以来人们认为FOXP3阳性T4调节细胞浸润肿瘤的预后较差，然而在结直肠癌（CRC）中这一细胞的存在却与预后有正相关性。Takuro Sait等人对这一现象的深入研究发现CRC中的FOXP3细胞可以分为两个亚型，当FOXP3阳性细胞不表达CD45RA时，分泌IL-12，TGF-β和TNFα并增加局部抗肿瘤免疫性。由于IL-12，TGF-β和TNFα无法通过免疫组化方法在原位进行检测，故该团队使用了RNAscope® Fluorescent Multiplex 试剂盒对这些细胞因子的分布进行原位检测[19]。
卵巢癌
在卵巢癌与炎症相关性的研究中，由于缺乏有效免疫组化抗体，Mamta Gupta等人通过RNAscope 2.5 duplex assay的方法检测了TNF-α与IL6在卵巢癌中的分布（见下图），结果显示TNF-α在卵巢癌中的转录表达与组织亚型有关，支持卵巢癌起始于炎症的假说[20]。
黑色素瘤
在一项研究IL8与抗PD-1治疗相关性的研究中，MF Sanmamed等人在接受了nivolumab 或 pembrolizumab单独治疗或者两者同时治疗的黑色素瘤和非小细胞肺癌病人血清内检测了IL8的水平，同时使用RNAscope方法检测了肿瘤原位IL8的定位以及表达水平与治疗效果的相关性。结果发现在血清中的IL8水平与肿瘤原位IL8的趋势一致，且在肿瘤内瘤细胞表达的IL-8水平高于肿瘤基质。血清中IL-8水平降低与黑色素瘤以及非小细胞肺癌的整体存活期延长有显著相关性[21]。
三、RNAscope原位检测方法对肿瘤微环境中免疫细胞，其他类型细胞以及基质中的研究
在对卵巢癌高转移且低存活率机制的研究中，Dong-Joo Cheon等人发现COL11A1胶原蛋白水平增加与卵巢癌疾病进展和高转移率相关。体外敲除COL11A1可以减低细胞的迁移，侵袭和肿瘤的增殖。由于胶原蛋白没有有效的免疫组化抗体，故该团队使用RNAscope的方法原位检测了COL11A1在肿瘤内和肿瘤旁的分布状况（下图）[22]。
tE： tumor epithelium； iS： intratumoral stroma； pS： peritumoral stroma；dS： distant stroma； F： fat.
Claudio Isella等人通过免疫组化和RNAscope的方法在蛋白和mRNA水平检测了预后不良的stem/serrated/mesenchymal (SSM) tranional subtype of colorectal cancer (CRC)基质中ZEB1的表达和分布，发现肿瘤基质来源的肿瘤相关成纤维细胞与结直肠癌的预后有关，提示了肿瘤基质在SSM型结直肠癌治疗和预后中的作用[23]。
在一项研究卵巢癌对铂类化疗药耐药的研究中，Lisa Ryner等人对复发后卵巢癌进行了研究。通过免疫组化和RNAscope方法分析肿瘤基质中POSTN，LOX和FAP的mRNA与蛋白水平的定位和定量（下图），证实肿瘤基质中的POSTN是无进展存活期缩短的指标。提示了肿瘤微环境在卵巢癌治疗中的作用[24]。
完
Reference:
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