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第八周第1节

 王博士的御书房 2018-10-04
miRNA好研究,第一没有翻译蛋白质省了工作量,第二短小好进细胞,第三作用机制比较单一。
miRNA作用于mRNA的3'UTR阻碍mRNA的翻译,和siRNA一样是结合risc。
miRNA的命名很好,都是miR后面接个数字,这个数字随着发现时间而增大。

检索miRNA的序列还有注释可以去miR base,查靶基因用targetscan。

研究miRNA和表型的关系,首先还是要看表达的差异性,这个用qPCR技术就行,看miRNA是否有表达差异。完了之后进行正反回复,需要做载体,一般用质粒,而且转进去的序列是前体miRNA的序列,前体miRNA在胞内会自动加工成成熟体miRNA,但是也可以直接买加工好的miRNA转进去更省事儿。要做lose of function就在质粒上加上目的miRNA相反的序列丢进细胞内就可以了。不管是过表达还是沉默,做完后都要再做qPCR验证一下。
细胞表型和动物表型的验证都一样

做完之后还要做确认靶基因,miRNA确认靶基因是一定要的,通过数据库可以预测有哪些靶基因靶点,做实验的话通过胞内过表达miRNA后通过qPCR和WB看预测靶点产物是否下调,还要做一个荧光素酶基因报告实验就行。把靶基因的3'UTR插入到荧光素酶报告基因的3'后转入胞内,然后过表达miRNA,如果miRNA和靶基因的3'UTR结合抑制靶基因翻译了的话,那么荧光素产生量就会下降,检测到的荧光就少。

以前一直认为miRNA只是阻碍mRNA翻译,但是现在认为miRNA还可以降解mRNA,而且降解比阻碍翻译更常见,所以选择靶基因的时候应该选去那些靶基因mRNA与miRNA负相关的靶基因。过表达miRNA后mRNA可以减少也可以不变,但是翻译的蛋白肯定减少这是金标准。

还有研究证明miRNA还可以通过稳定mRNA来上调翻译。。。非常小众,主要是阻碍翻译。

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