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如果你还是外泌体研究的萌新，那就先来一个科普小视频： 接下来是有关外泌体的提取（超离）和鉴定（电镜，流式，WB以及经典结果） 外泌体的超离提取 1. 在无外泌体的血清中培养细胞，因此，任何细胞培养液中添加的血清在4 ° C下离心120，000xg离心过夜后才能使用。  2. 将细胞悬液锥形管。 3. 在4 ° C沉淀细胞，离心10分钟300 XG。 4. 转移上清到超速离心机管，如果不彻底加入PBS。 
5. 样品16 500 XG离心20分钟，4 ° C至进一步去除细胞和细胞残骸。 6. 通过0.2微米过滤除去大于200纳米的颗粒来过滤上清液。 7. 过滤上清液转移到新的超速离心机管和120 000 XG ，在4 ° C下120，000xg离心70分钟。 8. 弃上清。 9. 重悬：这个缓冲液取决于以下目的，例如，裂解液用于蛋白质和RNA的分离，PBS是用于电子显微镜和流式细胞仪和功能的研究。 从视频大家可以看到，这种塑封管挺不方便的，一会要封，一会儿要剪，所以实际，很多都是使用以下这种pc管。 注;外泌体也可以从不同的体液，如血浆，使用相同的过程，作为细胞培养基中分离。对于粘性液体，它可能是必要的，用PBS稀释的样品离心和过滤步骤之前的。在上述5点的离心速度，它可以增加至29 500 XG，第7点中的离心可以延长至90分钟。 02 电子显微镜识别外泌体 1. 为了进一步消除污染蛋白，在4 ° C下离心120 000 XG 70分钟，至重新沉淀外泌体富集在PBS中 2.取蛋白分离和总蛋白测定样品的小等分。确保只有一小部分样品裂解和蛋白质测量，并保存完整的外泌体，PBS溶解，单独的冰或在-80℃为进一步的实验。
3.将一滴约10μg的外泌体蛋白在PBS中重新悬浮在PBS中。然后，用镊子轻轻地将Falvar碳涂层镍网格放置在每个滴的顶部30-60分钟。确保栅格定位在涂层侧面对含有脱落物的外泌体。  4.在Parafile上滴三滴PBS，每滴30μL，然后依次将网格定位在PBS滴的顶部来清洗网格，并在两者之间使用吸收纸。轻轻地将吸收纸轻轻地放在格栅的侧面，而不与涂布区域接触。 5.将样品滴入2%聚多聚甲醛上，将网格放置10分钟。 6.在用合适的抗体进行免疫染色之前，重复第4点的洗涤步骤。常用的抗体是抗CD63和抗MHC II类。电镜检查也可以进行，而不用免疫染色，因为外渗体可以只根据大小和形态来鉴定。然而，我们建议评估膜蛋白的大小、形态和存在，以进行更确凿的验证。 7.将网格转移到选择的初级抗体的30μL滴中，孵育40分钟。通过重复点4洗涤，但使用0.1%的牛血清白蛋白PBS溶液代替PBS。 8.重复第7点，但与10纳米金标记的第二抗体和单用PBS洗。 9.在样品上滴入2.5%的戊二醛后固定样品，然后将格子放在滴状物上温育10分钟。重复洗涤点4，但使用五滴去离子水代替三滴PBS。 10.将样品中添加2%的醋酸铀酰滴到药膜上，将培养液滴在液滴上15分钟。 11.将0.13%的甲基纤维素和0.4%的乙酸铀酰滴入膜中，嵌入样品，并在滴顶部孵育网格10分钟。 12.用吸收纸轻轻地除去多余的液体，然后将格子放在有涂层的一面朝上的纸上，让纸风干5分钟。 13.用电子显微镜检查制剂或将栅格储存在栅格箱中以备将来工作。 03 由流式细胞仪鉴定外泌体的表征 由于外泌体太小，不能用目前的流式细胞仪检测，因此有必要首先将外源体结合到抗体包被的珠子上（图1）。这些珠子既可以作为现成产品购买，也可以在实验室中用抗体选择。根据外体细胞的来源，不同的抗体可以结合到珠子上，珠子可以是磁性的，也可以是乳胶状的。我们目前使用抗MHC II类或抗-CD63涂层珠用于此分析。
 1.使用自制抗体包膜珠，用4μm乳胶珠涂覆抗CD63抗体。将25μL的4μm乳胶粒（30x 106粒）在100μLMES缓冲液中洗两次，3000x g洗15-20分钟，再溶于100μLMES缓冲液中。用相同体积的MES缓冲液制备体积等于12.5μg抗体的抗体混合物。在抗体混合物中加入珠子，并在室温下在夜间搅拌。用PBS(3000x g，20分钟)将抗体包被珠洗三次，然后将颗粒溶解在100μL的储存缓冲液中(最终浓度为300000珠/μL)。 2.对于每个样品(每个抗体)，继续以每~10万个抗体包被的珠子至少等于30μg(在PBS中溶解的完整的外体蛋白)的体积。 3.在4°C下，在温和的运动下，在300μL PBS的总体积下孵育外体和珠。  4.加入300μl 200 mL甘氨酸，孵育30分钟。 5.在洗涤缓冲液（PBS中1-3%血清）中洗涤两次外泌体珠配合物，600×g 10分钟。 6.在4℃下用50μLIgG抗体孵育外泌体-珠复合物，在洗涤缓冲液中洗涤外泌体-珠复合物两次，如步骤5所述。  7.将90μL的洗涤缓冲液和10μl的选择性抗体（理想情况下是抗CD9、抗CD63或抗CD81）加入外体珠复合物中，在温和运动下孵育40分钟。如步骤5所述，在洗涤缓冲液中洗涤两次外泌体珠配合物。 8.添加300μL洗涤缓冲液，用流式细胞仪采集数据。如上所述，可以使用不同的珠子，如在协议或磁珠中描述的乳胶珠。如果使用磁珠代替，请注意，协议略有不同。不需要阻塞步骤(点4)，并且通过将管置于磁性支架中而不是通过离心进行洗涤。用于“自制”抗体包被珠的储存缓冲液在PBS中含有0.1%甘氨酸和0.1%叠氮钠，pH为7.2。重要的是，确保使用流式细胞仪洗涤缓冲液（PBS中1-3%的血清）的耗尽外泌体血清，以避免任何血清外体污染分析。 注意：当使用抗体偶联珠进行外泌体特征化时，重要的是要承认它只是被分离和特征化的特定亚群，对所使用的抗体具有特异性。 04 用Western blot 检测外泌体  Western blot是一种已经建立的方法，我们不会详细介绍该方法本身，而是在Western blot和所使用的不同抗体之前，着重于合适的蛋白质分离的重要性。 1.在选择的蛋白质裂解缓冲液中溶解外泌体颗粒，涡流。为了进一步溶解外泌体，可将样品在水浴3×5分钟内用涡流混合在其之间进行超声处理。最后将样品离心，室温下离心13000×5分钟，并将上清液转移到一个新的Ep管中。 2.用选择的方法测定总蛋白，每孔装载20-50μg蛋白质。  3.通过凝胶电泳和电烙印分离和转移蛋白质。 4.在对富含外泌体的蛋白质进行免疫染色之前，阻断并洗涤膜。 5.通过化学发光、数字成像系统和分析软件检测特异性蛋白。 由于没有外泌体特异性标记，富含来自所有不同细胞来源的外源体的蛋白质通常用于外泌体检测。这些蛋白例如跨膜蛋白(例如CD9、CD63和CD81)和涉及多泡生物发生的蛋白(例如Tsg101和alix)。其他在外泌体中也普遍检测到的蛋白质是Flotillin、Hsc70和不同的rab蛋白等。然而，在外泌体中也发现了细胞特异性蛋白，如A33(肠上皮细胞)、CD3(T细胞)和MHC II类(抗原呈递细胞)。因此，取决于从检测到的标记物释放的外来细胞的细胞类型可能有所不同。 由于细胞的其他隔室也可以产生囊泡，因此还建议确定来自这些隔室的蛋白质的存在，例如内质网(例如calnexin和Grp78)和高尔基体(例如GM130)。因此，缺乏这些蛋白质表明没有或几乎没有污染的囊泡中的其他研究的样品。 05 外泌体的RNA的分离和分析 在选择的RNA裂解缓冲液中溶解外泌体颗粒并进行RNA提取。不同的RNA提取试剂盒可根据下游的实验，但基于列的方法提供样品与一个广泛的RNA。我们目前使用mircury RNA提取试剂盒由Exiqon，但其他组件可能适合手头的科学问题。 当进行RNA分离时，在无RNase环境中工作是很重要的。因此，使用核酸和无核酸酶的移液管提示，同时清除工作台和设备，不受污染物和RNase的影响。 1.RNA的分离，利用mircury RNA提取试剂盒，外泌体颗粒在350μL裂解液进行15秒的混合涡。 2.加入200μL的95%乙醇和涡流混合10秒。 3.在收集管中放置柱，并将裂解的外泌体转移到柱上，离心1分钟，在14×000克。  4.添加400的μL洗液含有胞外体RNA和离心1分钟14 000 x g柱洗三次 5.离心柱2分钟14 000 x g确保柱干燥的地方干柱在无RNA酶的Eppendorf管。 6.将50μL洗脱缓冲液加入到柱中，在200×g下离心2分钟，然后在14×000×g下1分钟。 7.继续分离RNA或储存在80°C。 8.对提取的总RNA的检测和分析外泌体，使用Agilent 2100生物分析仪与 RNA 6000纳米或RNA 6000 Pico试剂盒。  06 典型实验结果
外泌体太小，不能用现有的流式细胞术方法检测，因此在分析之前被附着在抗体包被的珠子上（图1）。 由于外泌体复合物可以聚集，流式细胞仪散点图可以包含不同种群的单珠、双珠和三珠（图2A）。箭头表示进一步分析的单个珠子。图2B显示了CD63阳性的单珠外泌体细胞群体与其同种型对照相比。 由于外泌体的小尺寸，它们只能用电子显微镜直接观察，而不是通过光学显微镜观察。外泌体的典型形态特征是圆形和30～100nm大小的膜囊泡。在图3中，电子显微镜照片显示用金标记的CD63抗体（箭头所示）和非免疫染色的外泌体（B）免疫染色的外泌体（A）。 为了确定分离的囊泡确实是外泌体蛋白并进一步鉴定外泌体蛋白，通常使用蛋白质印迹。图4显示了钙内毒素缺失的内质网标记物。这表明内质网囊泡的污染很小。此外，图4显示了CD81在外体中的存在，这是通常在外泌体中富集的四联棘素。 细胞RNA主要含有核糖体RNA（rRNA），在生物分析仪分析中，它被认为是18S和28SrRNA亚基的两个显著峰（图5A）。然而，由于外体缺乏两个rRNA峰（18S和28S），并且富含短RNA，如mRNA和miRNA（图5B），因此外泌体RNA的分布不同。 胞外囊泡与外泌体：技术分享，前沿交流，共同进步！ |
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