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1. 出现黑点或黑斑
原因：试剂污染，抗体结合到封闭剂
解决方法：使用新鲜配置的试剂；过滤封闭液；选用其他类型封闭液
2. 条带中出现边缘规则的白圈
原因：转膜时膜和胶中间有气泡，或抗体在膜上未均匀分散
解决方法：制备转膜凝胶时用玻棒赶去气泡；使用摇床孵育抗体
3. 条带拖尾
原因：样品有未溶颗粒；分离胶浓度偏大
解决方法：充分溶解，加样前离心；换小浓度分离胶
4. 条带扭曲，如微笑带
原因：胶未配好（凝胶未能完全聚合，胶中有颗粒或气泡，凝胶未冷却好，）；电压过高；
解决方法：正确添加质量合格且未过期的 AP 及 TEMED；过滤配胶的试剂保证配胶过程中胶内无气泡；凝胶冷却好后再上样；降低电压
5. 出现非均一性背景
原因：膜可能曾经干过
解决方法：在实验过程中要保证膜一直处于湿润状态
6. 条带中间出现白色（反白）
原因：中心部位高浓度 HRP 将底物消耗过快，中间部位底物消耗完后无法发光
解决方法：降低蛋白量，降低一抗与二抗的浓度
7. 高背景
原因 | 解决方法 | 抗体与其它蛋白质交叉反应 | 更换不同的封闭液；勿在 Biotin/avidin 体系中使用脱脂奶粉封闭 降低二抗浓度 检测二抗与膜的交叉反应性 | 一抗浓度过高 | 降低一抗浓度 | 漂洗不完全 | 增加漂洗时间和缓冲液体积 漂洗液中加入 Tween20；浓度 0.05％ | 曝光时间太长 | 缩短曝光时间 | 膜的问题 | 使用干净镊子；戴手套操作 ； 换一张新膜 用足够的液体，膜始终保持湿润 孵育时使用脱色摇床 避免膜重叠，互相覆盖 小心操作，勿毁损膜 | 洗膜不充分 | 增加洗涤次数 | 膜不合适 | NC 膜比 PVDF 膜背景低 | 膜干燥 | 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 | 缓冲液污染 | 使用新缓冲液 过滤缓冲液 |
△ 调整一抗浓度
△ 调整封闭液浓度
△ 调整曝光时间
△ 调整封闭液种类
8. 非特异性条带（杂带）
原因 | 解决方法 | SDS 非特异性结合到胶上的蛋白质 | 转膜后充分清洗 ; 不用 SDS | 细胞传代次数过多，使其蛋白表达模式的分化 | 使用原始或传代少的细胞株，或平行实验 | 蛋白样本降解 | 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 | 新蛋白或同族蛋白的分享同种表位的不同剪接方式 | 查其它文献报导，或 BLAST 搜寻，使用说明书报导的细胞株或组织 | 抗体未纯化 | 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带 | 蛋白存在二聚体或多聚体 | SDS-PAGE 电泳上样前，加 DTT, 再煮沸变性，以增强蛋白质解聚变性 | 许多蛋白质有多个亚型，分子量不同 | 查阅文献或进行生物信息学分析，抗体针对几个亚型，就会有几个条带 | 蛋白本身有多个修饰位点 | 查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，确 定分子量 | 一抗浓度过高 | 在满足一定的敏感性的情况下，降低一抗浓度 | 二抗引起的非特异条带 | 只加二抗做对照，检查非特异条带是否由二抗引起 降低二抗孵育浓度 更换交叉反应小的二抗 抗小鼠二抗易和大鼠组织和细胞发生交叉反应，选用吸附过的二抗 | 上样量过高 | 适当减少上样量 | 洗涤不完全 | 可适当延长洗涤时间 | 封闭不好 | 延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液 |
另外，有些情况下的「杂带」带可能并不杂，例如
类型 | 说明 | 翻译后修饰 | 磷酸化、糖基化等会增大分子量 | 剪切体 | 许多蛋白由前体剪切后才带有活性，其分子量会变小 | 多聚体 | 二聚体、三聚体等，分子量会成倍增加 | 异构体 | 同一基因经选择性剪切产生不同大小的蛋白 |
翻译后修饰对分子量的影响：
类型 | 涉及蛋白 | 对分子量影响 | 泛素化 | 种类广泛 | 变化大小为 8KD 的倍数 | 磷酸化 | 信号通路相关激酶 | 增大 2-5KD | 糖基化 | 糖蛋白，一些膜蛋白，如 CD 分子 | 视糖基化的程度，变化范围很大 | 甲基化 | 组蛋白家族及表观遗传学 | 变化不大 | 乙酰化 | 组蛋白家族及表观遗传学 | 变化不大 |
△ 糖基化引起的分子量变化
△ 多聚体引起的分子量变化
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