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现代疫苗的概念和范围 现代疫苗的概念和范围（Concept and Scope of Modern Vaccines） 前言 从古至今，在各种医学干预技术中，疫苗接种可能对人类健康有最大的作用。免疫接种是唯一能遏制甚至彻底消灭感染性疾病的最具成本效益的方案。疫苗学可以追溯到古代中国，天花接种过程中，人们植入了少量从受感染病人身上病变处取出的痂来预防天花[1]。18世纪早期，玛丽·蒙塔古夫人在发现土耳其人实行天花接种之后，积极在欧洲宣传倡导这种方法来预防天花。 现代疫苗学始于爱德华·詹纳（Edward Jenner）所做的科学努力，他经过研究发现牛痘脓包可以预防天花感染[2]。在疫苗学历史上，他的工作首次得到科学的评估，确认具有相关性且危险性较低的病原体可激发对较强的病原体的交叉保护作用[3]。詹纳具有开创性的发现在随后近一个世纪都未被有效利用，直到路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）证明通过为家鸡接种减毒性病菌可使其免受霍乱的威胁[4]。类似的实验也表明，可以用同样的方法使羊群对炭疽病具有免疫力[5]。毒力减弱的病原体可激发免疫系统产生反应，这一概念就是结核病疫苗卡介苗（BCG）诱发免疫功能的基础，卡介苗在1921年[6]首次使用，而且在今天仍被广泛使用。 疫苗的定义是利用病原体的免疫原制剂来激发免疫应答而不会引起疾病。虽然病原体的减毒和灭活是传统的方法，且在今天仍被使用。不过现代疫苗也在免疫学、基因组学、生物信息学和结构及蛋白质化学方面做了新的探索和开发。所有疫苗的核心都是抗原——T和B淋巴细胞受体的配体。淋巴细胞是适应性免疫系统的效应细胞，能够调节免疫记忆反应——疫苗接种的显著标志，而免疫记忆反应正是疫苗接种区别于其他现代免疫系统操作的特点，例如广谱的免疫增强剂、细胞因子治疗或来源于人类血浆的特异性超免疫球蛋白的被动传递。 在前基因组时代的经验主义的研究方法之后，现代以及未来疫苗的范围已有明显扩展。现在可以理性地甚至是依据不同个体的需要来设计疫苗。疫苗学在很多领域的发展，从佐剂、蛋白质组学、表达库免疫接种（ELI）和亚单位疫苗，直到创新性基金募集和慈善事业，都不断地取得里程碑式的成就。然而在其前进的道路上还有不少挑战。疫苗发展还没有突破现有技术的限制，而且也缺乏激励机制。 下面我们就列举目前的疫苗技术的一些局限，在接下来的章节中也会探讨可能推进疫苗学发展的技术。 当前疫苗接种的成功和局限 除了人们支付得起的营养品、干净的饮用水和卫生设备，接种价格低廉的疫苗是能够保护人类健康的唯一最划算的医疗措施。大规模的免疫接种项目已经直接导致几种传染病得到控制，这个事实就是有力的证明。例如在美国，白喉、麻疹、腮腺炎、百日咳以及其它很多常见病的发病率已经下降了超过99%（见表1.1）。在天花案例中，在世界卫生组织（WHO）领导的共同努力下，天花在世界范围内已经得以根除。由于世界各方协调性的努力，小儿麻痹症的发病率每年都在下降，由原来年发病率近35,000例，到1996年已降到少于4,000例（见图1.1）。同样，由于麻疹疫苗接种的数量在过去20年中的提高，报告的麻疹感染病例数也已经减少了（见图1.2）。 此外，通过控制疾病传染，疫苗还减少了未来的治疗费用（见表1.2）。疾病控制中心（CDC）也强调了因疫苗而减少的医疗费用，CDC估计在免疫接种上每花1美元就能省下2~29美元。全球天花根除计划所需全部费用为3,200万美元，因不再需要向旅行者注射疫苗，这笔费用在短短的20天时间内就可收回。这里尤其值得一提的案例是能预防麻疹、流行性腮腺炎和风疹的联合疫苗（MMR）。仅1992年一年，在美国MMR的免疫接种大约就直接或间接节省了51亿美元的医疗费用。 虽然疫苗在预防儿童传染病，例如麻疹、白喉、脊髓灰质炎和脑膜炎方面有作用，但在资源短缺国家还是有很多传染病是疫苗计划还没有覆盖的，如疟疾、沙门氏菌病和肺结核。这几种传染病疫苗缺乏的原因有以下几个： 遗传不稳定性。针对很多病原体的预防接种的一个主要障碍是不可预测的抗原变异。抗原变异本质上并不是不可克服的挑战：当前的疫苗技术已经能保护我们免受血清型数目不是太多的病原体的侵害了，例如脊髓灰质炎（3个血清型）和轮状病毒（4个血清型）；在原则上可能扩展到有数十甚至上百种株型的病原体，比如脑膜炎链菌（已知有90种血清型）。 大家都知道个体会对一种特殊病原体的很多菌（毒）株产生免疫力，证据是在过去二三十年中自然暴露于疟疾或普通感冒可获得免疫力。利用适当疫苗也可以在较短时期内达到同样的效果，不过真正的挑战是如何使人体对尚未出现的病原体或病原体株系预先产生免疫力。虽然适应性免疫系统预存的抗体谱具有对任何抗原作出反应并保存免疫记忆的能力，目前生产疫苗的条件是要预先知道这些抗原。HIV就是一种最具危害性的病原体。尽管我们知道gp120具有保护作用，但是HIV在复制时会产生无数的截然不同的分子，因此人们开发HIV疫苗的大部分努力都没有结果。这是开发针对具有不可预知抗原变异的病原体的疫苗的最主要障碍。 复杂性。 随着病原体染色体组变大及其生命周期中有更多的变化阶段，开发疫苗工作也更加复杂。大部分成功的疫苗都是针对病毒的，很少一部分是针对细菌的，也有个别几种疫苗是针对寄生虫或真菌的。为了通过预防接种达到免疫的效果，一种疫苗要能够在不引起疾病的前提下模仿自然感染的免疫原性成分。减毒疫苗不具备亲本病原体的致病性但有激发保护性免疫力的能力。通常只需一次接种，免疫能力会终生保持。根据这一标准，最好的疫苗无疑就是活的、减毒的病原体。然而，今天的趋势是开发亚单位疫苗或灭活疫苗，因为它们没有毒力逆转的风险。 灭活疫苗会保留活的病原体的固有免疫特性（例如细胞壁的成分），若灭活没有完全的话这些疫苗也可能含有活的病原体。灭活疫苗的这些风险意味着其会逐渐被更安全的亚单位疫苗、重组蛋白质疫苗或核酸疫苗取代。遗憾的是，研制重组蛋白质疫苗也面临着很大的挑战，尤其是那些抑制细菌或寄生虫的类别。除非致病性是由单一成分介导（例如一种外毒素，可以用一种简单的类毒素疫苗来提供保护），保护性免疫会倾向于多数是由对多个抗原的反应来介导的。迄今为止，单一重组蛋白疫苗在对细菌的预防上效果尚不理想。 保护相关性。这里的问题是人们缺乏对产生保护作用的抗原的了解。我们通常用体外技术来衡量病原体的免疫应答，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）、中和测试和干扰素释放试验。这些方法会很复杂，且需要确定抗原谱甚至是精确的表位。人们还假设，由于有抗原和介导保护作用的T细胞，可检测的反应会同时发生，至少部分重叠。但是很多反应可能与免疫无关。仅仅因为我们能检测出对某一特定抗原的反应，并不一定就意味着其具有主要的保护作用。相反，对产生保护性反应起关键作用的抗原也许不能通过体外测试检测出来。所以疫苗中所用的抗原不一定在自然感染中具有免疫原性。可测量的反应体“（reactome）”和“保护体（protectome）”之间的重叠基本上还是一个未经探索的领域。 佐剂。 有时人们对现代疫苗的期望是不现实的。当前的疫苗是用于健康个体的，属于预防性的。所以对其安全性和效益应当认真权衡。虽然亚单位疫苗是目前最安全的，不过其安全性和功效有轻重之分。大部分亚单位疫苗和重组蛋白质疫苗都缺乏减毒病原体固有的促炎症反应的特性，所以需要佐剂的辅助作用。由于目前尚不完全清楚的原因，含佐剂的蛋白质激发的免疫反应比活的病原体产生的免疫反应衰减的速度要快，所以前者需要进行加强免疫接种。肿胀、疼痛和发烧——好的佐剂所需的促炎症反应特性——被认为是不可接受的副作用（儿童发烧时父母所承受的压力就是证据）。这些副作用和疾病相比有些微不足道，不过只有极个别的佐剂被官方批准适用于人体，而且都是被证明其副作用比较温和的。归根结蒂，要疫苗接种在不引起某种副作用的情况下产生完全的免疫力几乎是不可能的，所以最好的疫苗通常都是某种妥协的结果。 影响疫苗设计的现代方法 基因组学 在前基因组学时代，疫苗来自动物病原体或者由人类的病原体通过非正常成长环境减毒或化学灭活而成。很多成功的疫苗都是通过经验主义的方法开发出来的。不过后来被病原体提取物或者说是亚单位疫苗取代了，即用病原体的成分取代整个病原体的方法。在后基因组学时代，亚单位疫苗的生产变得更合理。抗原的准备也得到了更精确的控制。虽然还存在一些不足，重组蛋白疫苗已经而且将会对因简单病原体——尤其是病毒——引起的疾病起主要的预防作用，一种抗原通常就足够激发免疫力了（例如乳头瘤病毒HPV）。即使对于更复杂的病原体例如细菌和寄生虫，重组蛋白质疫苗也是可以起到保护作用的，尤其是使用保护性抗原的佐剂鸡尾酒时。不过在确认候选抗原时并不那么顺利，问题一直是染色体组太大和可用的潜在的抗原数量；直到最近，发现潜在的亚单位疫苗抗原的工作一直不够系统也不够全面。 现代高通量全蛋白质组表达和筛查技术可能带来一场革命，促进新的疫苗抗原的发现来预防古老的疾病。最近一项对疟疾的获得性免疫的抗体分析研究（如在冈比亚的研究），确认了具有获得性免疫的儿童身上所带有的几种抗原的抗体，而这样的后天免疫抗体是仍在感染季节性疟疾的儿童所缺乏的。这些抗原会被看做是疫苗开发的主要目标。重要的是，同样的研究揭示出目前正在临床试验中评估的抗原可能并不包括在这些有差别的抗原中。类似的研究所得出的结论是，与传统的“直觉”方法相比，无偏见的筛选方法可能会促进不同抗原集合的发现。这些新抗原是否会导致产生更好的疫苗还有待研究，本书第三部分会重点讲解这些新技术。 改进的投递系统和佐剂 重组蛋白质的绝大部分免疫原性都不好，而且需要以免疫原组合的形式进行接种。重组蛋白质最成功的投递系统通常是基于一种或另一种大分子集合，而且可以以免疫刺激复合物、脂质体、或病毒样粒子的形式呈现。结合到无机离子如明矾上的抗原的悬浮液也具有免疫原性。树突细胞似乎在摄取不能溶解的微粒抗原反应上特别有效，但对于水溶性蛋白而言就不那么有效。还可以采取其他措施来提高现有疫苗的免疫原性。例如，肽疫苗在活的病原体内寿命会减半，但是可以通过化学修饰来提高其稳定性从而得到改进。核酸疫苗虽然在动物体内试验时效果很好，但是目前在人体中还不是很成功。这种问题的原因尚不清楚，不过其效果可以通过使用活的载体进行加强免疫来改进。重组载体例如牛痘或腺病毒的免疫原性会被预先存在的免疫削弱，不过这一问题可以通过采用动物病毒载体如禽痘病毒来克服，因为不会预先存在针对动物病毒载体的免疫。这些例子以及其他抗原工程技术会在第四部分详细阐述。 治疗性疫苗 目前还没有一种获得许可、用于人体的传统疫苗是治疗性的，而都是预防性的，依赖于抗体来阻止随后的感染。感染之后接种疫苗以治疗（而不是预防）疾病，这是现代疫苗接种的现实目标。一旦病原体引起了感染，消除感染所需的免疫应答的类型很大程度上取决于病原体是在细胞外还是进入到了细胞以内,抗体是无法进入细胞内部的。治疗性疫苗的优化来自于八九十年代对T细胞识别和抗原加工/展示的认识的巨大进步；专门针对细胞免疫的疫苗可以对驻留在细胞内部的病原体产生防御作用，这一发现也推动了治疗性疫苗的改进。CD8+T 和CD4+T细胞都能杀死藏有细胞内病原体的细胞，尤其CD4和CD8分别作用于寄居在内含体中的病毒和细菌。很多动物模型系统都提供了治疗性疫苗的原理性证明。但是将该原理应用到实际的疫苗，以抗体疫苗为例，开发上的瓶颈是病原体基因组的大小。尤其是对于T细胞，如果疫苗接种需要合成多肽的话，问题就更复杂了。不过，高通量的蛋白质组筛查平台和不断改进的预测算法有望确定所需的抗原，同时需要认真选定接种方法或佐剂，以确保能激发正确的T细胞亚群。 虽然治疗性疫苗领域仍然在针对传染性疾病而努力开发，不过在癌症免疫疗法方面已经取得了可喜的进展。这些技术所依赖的基础是特定细胞免疫应答的体内活化和放大，随后再对病人重新输入免疫细胞，后者与体内活化的思路正好相反，是传统疫苗希望实现的。此项技术的肿瘤学应用目标有很多。不过，美国食品和药物管理局批准了Dendreon公司开发的疫苗Sipuleucel-T ( 商品名Provenge)，该疫苗用于无症状或最少症状已转移的雄激素非依赖性前列腺癌，这为癌症免疫治疗的发展添加了动力。 减毒疫苗的回归？ 除了类毒素是典型的例外，针对复杂病原体（细菌、真菌、寄生虫）的单一重组蛋白亚单位疫苗之前的疗效令人失望，这促使我们在开发亚单位疫苗的同时继续开发减毒活疫苗，目的是最大可能的找到针对任何特定病原体的疫苗。虽然由于致病表型逆转的风险导致对其安全性的要求更加严格，减毒活疫苗比亚单位疫苗和死疫苗有很多优势。现在允许用于人体的减毒活细菌疫苗包括牛结核分支杆菌（上世纪20年代研制）、伤寒沙门氏菌Ty21a（70年代研制成功）、霍乱弧菌CVD 103-HgR（80年代研制）。后者是从霍乱毒素基因的定点诱变衍生出来的，从某些方面来看它代表着传统霍乱类毒素疫苗的另一面。 虽然减毒疫苗是容易实现的目标，不过它提示将来可以通过理性的方式研制出这样的疫苗。对大部分细菌来说，多个毒力因子都与致病性有关。传统的病毒减毒方法（如被迫适应差异生存环境或放射/化学诱变）与现代科学理性的方法相比，太过偶然了。随着对病原体序列解析速度的加快，有望对毒力因子及其诱变或删除目标作出系统的识别。筛选大量突变体以研究减毒和免疫原性的技术还需要继续开发，而且很可能会涉及体外模式。 与减毒疫苗密切相关的是基于动物病原体的疫苗——采用“琴纳”（Jennerian）方法。天花疫苗通常被认为是所有疫苗的原型，而且是唯一导致根除了一种人类疾病的疫苗。原始天花疫苗（牛痘）的原理跟其后的减毒疫苗和死疫苗还有所不同。牛痘不是人类病原体的减毒版，而是与人类病原体特别相近、致病性更低、同属于正痘病毒属的病毒。人们对牛痘的起源还不是很清楚，不过现代系统进化分析表明它是牛痘的“驯化”版。虽然基于动物病原体的疫苗致病性更低，不过更可取的还是减毒菌株。有复制能力的天花病毒疫苗正在被减毒痘苗病毒毒株例如MVA所取代。减毒牛型结核分支杆菌菌株BCG，最初是在上世纪20年代作为结合分支杆菌疫苗而生产的，它也符合琴纳原理。更近一点的例子有人类－动物病原体重组而成的轮状病毒疫苗，它是通过构建含来源于人类轮状病毒抗原的动物轮状病毒而成功开发的。 改进现有疫苗，促进疫苗推广 大部分减毒活疫苗的功效都很有限，部分原因是过度减毒。所以现代疫苗科技必须努力改进现有疫苗，包括研制效力更好的佐剂或佐剂组合，或者改进其生产方法。毫无疑问，对免疫过程的基础研究会继续开辟提高现有疫苗的免疫原性的新途径。Toll样受体作用的发现和现代免疫学技术的应用使我们对佐剂的基础有了更进一步的理解。同样，对抗原加工路径以及不同的调节性和效应性T细胞亚群的理解，揭示了抗原递送（接种）在诱导免疫反应类型方面的重要性。在将来，关闭抑制路径和启用促炎路径的免疫调节剂，或针对免疫系统特定的细胞和组织的抗原的配体，有可能会常规地整合到新疫苗中。在不远的将来，我们对其他关键过程，如免疫记忆和免疫显性会有更加清晰的理解，并将影响我们对所用的疫苗和佐剂的设计。 应当记住，我们并不需要去发现能对全球卫生状况产生重大影响的新疫苗。据WHO估计，每年有270万儿童死于用现有疫苗可以预防的疾病，并且其中有一半是由轮状病毒和肺炎链球菌引起的。这种情况大部分发生在资源贫乏的国家。WHO 扩大免疫规划（EPI）始于1974年，目标是为全世界的儿童都能接种疫苗。通过全球疫苗免疫联盟(GAVI) (www.gavialliance.org)，该规划近来扩展覆盖到世界最贫穷的国家。自满和误导是发展中国家的主要问题，而且威胁到削弱疫苗诱生的保护。仅仅因为一种疾病已经不像它刚出现时那么流行，人们就误认为该疾病已经被彻底根除，因此如果不维持疫苗接种，将会导致疾病的再次出现。很显然，强制性儿童疫苗接种很重要，但在大部分国家基本上还是自愿性质的。不管人们是否认为麻风腮三联疫苗(MMR)是自闭症发展的诱因之一，由于最近的歇斯底里减少MMR接种，已经直接导致儿童麻疹病例的上升。 未来的困难和挑战 针对非传染性疾病的现代疫苗 人们对自身抗原，尤其与癌症和自体免疫病相关的识别，为疫苗接种创造了新的机会。这主要是接种在已经患有疾病的个人身上的治疗性T细胞疫苗。与传统的致病微生物的免疫原性制备相比，这种疫苗显著扩展了“疫苗”的概念，而且最近获得批准的HPV疫苗其实也是在病毒相关癌症预防性疫苗接种上的重大进步[20]。 从研究到临床试验的转变 疫苗杂志（及本书）中随处可见关于新颖而且有独创性的疫苗、呈递系统、佐剂、疫苗载体和科学方法的报导。但是只有对最简单、最安全的疫苗才会考虑进行临床试验。事实上对于大多数进行基础疫苗研究的学术实验室而言，获得必要的批准，研制出符合现行优良药品制造规范（GMP）的疫苗，以及得到资金支持都是遥不可及的事。即使一种候选疫苗通过了临床研究的一、二期评估，但是第三期试验所需的资金超出了大部分政府资助机构的能力范围，需要企业的参与。例如据估计，将GardisilTM——一种含四种重组蛋白的HPV疫苗——引入市场的研究和开发成本超过10亿美元。对于研究和开发利润较少的疫苗和诊断方法所面临的资金问题，人们也已经作出了各种努力，如税收优惠和政府采购保障等。此外，非盈利组织如维康（Wellcome）基金会和最近的比尔和梅琳达·盖茨基金会，已经成为疫苗研发的主要推动力。所以，在科学界、医药行业、非盈利组织以及政治实体的相互合作之下，疫苗学会继续发展，进而满足全球医药领域的需求。 （原创： yan jiaxin 翻译自学术专著：: Vaccinology, Principles and Practice (疫苗学，原理和实践) 2012, Oxford, UK: Blackwell Publishing）
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