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莫愁：首先感谢大家上周请的咖啡，真的十分感谢大家！让我们觉得我们的付出也是值得的！今天又是神师兄为我们来讲Seminar…… 实验万事屋作品 神师兄：为毛老是我啊，上次不是讲过了么，能不能换一换啊…… 实验万事屋作品 莫愁：不行，我刚出月子，右哉太太才生完，数了数就也只有你了……再说上次喝咖啡你也有份啊！赶紧开始吧！ 实验万事屋作品 …华丽丽的分割线… 实验万事屋作品 神师兄：好吧，还是讲点轻松容易懂的。今天给大家讲的是一篇Nature Genetics（IF=29.648）吧，这也是今年发表的。文章的题目是：A prostate cancer susceptibility allele at 6q22 increases RFX6expression by modulating HOXB13 chromatin binding。里面会涉及到一些实验，要莫愁来给大家讲解的哈。 实验万事屋作品 实验万事屋作品 这篇文章题目看似也蛮平常的，其实也是有丰富内容滴。首先这篇文献的题目提到了“allele”，也就是一对前列腺癌易感的等位基因，这对等位基因，通过HOXB13增强了RFX6的表达。这个故事的主角就已经浮现出来了。前列腺癌，HOXB13，“allele”，RFX6。 实验万事屋作品 好了，故事要开始了。首先出现的是一个主角，是HOXB13，这是一种转录因子，在前列腺癌中也举足轻重，它在前列腺癌中，结合雄激素受体后，启动转录。 实验万事屋作品 关键的关键，这篇文章把这两个看似不想干的内容给凑合到了一起。由于HOXB13是一种转录因子，那就是说HOXB13是可以结合到DNA上的，于是，就用HOXB13的ChIP结果去和GWAS上前列腺癌易感的SNP数据做了比对，结果发现还真就有那么几个SNP位点有可能有关系。于是这篇文章的第二个主角就出现了，rs339331，这个位点在GWAS的注释上表明了是一种与前列腺癌密切相关的SNP位点。 实验万事屋作品 实验万事屋作品 那两者的关系又是什么呢？那就比对一下吧，比对下来，这个SNP位点，还真就落在HOXB13的中间。同样用Luciferase和EMSA进行检测（这个莫愁来说明吧！），证明了的确这个SNP位点高危型的等位基因的确能和HOXB13结合，并且不是与HOXB13这个复合体的其他基因相互结合。 实验万事屋作品 那既然rs339331的易感等位基因，是可以被HOXB13结合上去的，那它是不是一个转录激活位点呢？于是就做了以下实验，首先检测了一些ChIP实验（这个问莫愁吧！），主要是拉转录激活标志性的组蛋白修饰位点：H3K4me1啊，H3K27ac啊之类的（这个咋回事？问莫愁！）。用PSA的enhancer做了个阳性对照，证明，确实是有转录的激活。而ChIP-seq实验同样证实了这一点，并且证明rs339331位于它所在的这个基因RFX6的转录激活位点。到这里第三个主角RFX6隆重登场。同时用FAIRE-qPCR技术进行检测（具体问莫愁！），确定了rs339331的确是在转录激活域（核小体缺失段）。由于HOXB13启动转录需要有与AR结合，于是作者就做了一个二氢睾酮激活AR的Luciferase实验。的确，HOXB13起到了作用，在二氢睾酮的作用下促进了Luciferase的荧光。 实验万事屋作品 实验万事屋作品 既然rs339331是在RFX6的转录激活位点上的，那么，HOXB13就应该能对RFX6起到相关的转录调节作用。敲减HOXB13后RFX6的表达也会受到影响，同时用Luciferase实验也证实了HOXB13对于高危型rs339331[T]敏感性。同样，rs339331位于RFX6内含子，那这样的话，HOXB13激活的转录应该就是HOXB13所结合的高危等位基因[T]这个转录本，转录本测序结果也证实了这一点。也就是说，HOXB13的确对rs339331敏感。 实验万事屋作品 实验万事屋作品 既然已经到了最下游的基因——RFX6，那怎么能不做一下它的表型呢？于是发现果然，敲减RFX6后，对肿瘤生长及迁移侵袭都有明显的抑制。 实验万事屋作品 实验万事屋作品 那最关键的问题来了，回到临床，这个发现是不是有意义。对于临床样本的分析发现，分期较高的前列腺癌，RFX6表达都较高。同样高表达RFX6，预后也很差，生存曲线一直在掉。那跟rs339331有啥关系呢？当然有关系，不同分型的rs339331与RFX6的表达有着直接联系。 实验万事屋作品 实验万事屋作品 故事讲到了这里，整个故事就串起来了。HOXB13（结合了AR的蛋白复合体）通过HOXB13结合到rs339331的高危型等位基因[T]后，激活了RFX6的转录，导致了前列腺癌的恶化。 实验万事屋作品 实验万事屋作品 …华丽丽的分割线… 实验万事屋作品 李莫愁博士：省事兄为了省事也是蛮拼的，先把他留下的悬念解释一下。 实验万事屋作品 1）ChIP：染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是一种研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。大概的原理见下图 实验万事屋作品 实验万事屋作品 2）组蛋白修饰：1999年，Strahl,B.O等人发现，在生物体中组蛋白上赖氨酸存在三种不同程度的甲基化修饰：单甲基化（me）、二甲基化（me2）及三甲基化（me3）。在染色质生物学领域，主要的挑战集中在如何确立特定的甲基化状态与功能之间的内在生物学联系。举例来说，3型组蛋白尾端的第四个赖氨酸（H3K4）在激活的常染色质区域为二甲基化，而H3K4me1的话通常位于enhancer附近。同样，H3K4在活化基因的转录起始位点通常是被三甲基化修饰的，而在沉默的异染色质位点是未被甲基化的。这意味着带有不同程度甲基化修饰标签的组蛋白在异染色质形成和X-染色体失活及转录调节的过程中起着非常独特的生物学功能。而H3K27位点的组蛋白的乙酰化，也代表了该位点被激活。 实验万事屋作品 3）EMSA：凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术。它可以用于：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。大概的原理见下图 实验万事屋作品 实验万事屋作品 4）Luciferase分析：转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。萤光素酶报告基因实验(luciferase Assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，其原理简述如下：(1)用靶启动子的特定片段替换报告基因质粒(如pGL3-basic)的启动子区；(2)将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转。如果该转录因子能够激活靶启动子，则萤光素酶就会表达，且其表达量与转录因子的作用强度成正比；(3)加入特定的底物，萤光素酶与底物反应，产生萤光素，检测荧光的强度可以对萤光素酶的活性定量，进而判断该转录因子能否与靶启动子片段发生作用(及其作用强度)。大概原理见下图 实验万事屋作品 实验万事屋作品 5）FAIRE（Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements，甲醛辅助交联调控元件分离方法）：一般人类基因组里，缺失核小体的部分，会强烈富集DNA酶I超敏感位点，转录起始位点，以及启动子位点。FAIRE就是为了检测这些核小体缺失的染色质片段而设计的DNA富集技术，大概的原理见下图。 实验万事屋作品
实验万事屋作品 这篇文章可以说是一篇转录因子研究的范文，包括了以上大量的转录因子研究的相关实验。文章的思路还是很明确的，简单点描述就是：转录因子与位点及基因和表型的关系。 实验万事屋作品 除了上述大量的转录因子研究必备的实验工具以外，其中还涉及了结合位点的突变（等位基因）不结合，转录起始位点研究，转录因子介导的转录验证实验等等，和转录因子研究极其相关的内容。细细思量一下，你就会得到更多……普通的转录因子研究，可能会呈现这样的套路： 实验万事屋作品
其实文章的亮点还有很多，光是将SNP引入到转录因子的研究中，已经算是很有想法了。而这篇文章也给出了一个新的思路，这个思路有点类似于反向遗传学，也就是从机制来回溯到表型的一个过程。整篇文章都是在研究转录调控的机制，而在最后才把所有的机制回归到肿瘤的表型中，然后上升到一个临床的高度，基本上就比较完美了。 实验万事屋作品
实验万事屋作品 好了，今天就跟大家策到这里了。想再回顾一下GWAS和SNP的内容的话，就回复“172”、“196”、“204”。想看今天的文献，回复“S006”如果想要看之前的Seminar的话，就按照下面的数字来回复吧。
170 【万事屋Seminar】3分SCI文章的简单思路 177 【万事屋Seminar】简单策略：如何把别人的芯片变成我的Plos One 184 【万事屋Seminar】热气腾腾的5分SCI——LncRNA & ceRNA 191 【万事屋Seminar】13分的SCI怎么讲故事？！越看越带劲！ 198 【万事屋Seminar】23分的SCI是怎么推理的呢！？欲罢不能的推理剧！ 感谢大家一直以来对“实验万事屋”的支持，有很多小伙伴对万事屋和背后辛勤工作的右哉和李莫愁博士充满好奇。 问：你们办这个干什么？ 答：初衷是帮助那些被研究搞爆了头的临床大夫。 问：你们为什么不多雇些人来写帖子？ 答：因为平台没有收入，写作只是我们俩闲来时的娱乐。 问：那你们俩“好傻”噢！ 答：要头脑还灵光也不会走上读博这条路. 问：没有收入坚持大半年不容易，请你们喝杯咖啡吧！ 答：不用不用，搞这么客气做什么。（心里话：下面是我们的支付宝账户：） huangyue19871212@126.com 或者支付宝二维码扫一扫，轻松付款 捐10元喝奶茶，捐20元喝果汁，捐50元喝星巴克。你们都要请喝星巴克？好感动，不用不用，搞那么客气做什么，我们会不好意思的。（心里话：想请就请，多少随意！） |
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