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导读 一、转录因子定义与分类 1.转录因子定义 2.常见转录因子（TF）类型 二、实验设计思路 1.实验课题设计思路： ①实验课题设计思路-lncRNA研究 ②实验课题设计思路-lncRNA表达与特征 ③实验课题设计思路-lncRNA调控基因 ④实验课题设计思路-lncRNA通过转录因子调控基因 ⑤实验课题设计思路-lncRNA.基因体内功能 2.HAND2-AS1通过E2F4调控C16orf74介导宫颈癌发展 ①lncRNA HAND2-AS1在宫颈癌中表达下降 ②HAND2-AS1抑制C16orf74的表达 ③HAND2-AS1抑制宫颈癌细胞增殖迁移 ④HAND2-AS1通过C16orf74/ PPP3CA调控宫颈癌发生 ⑤HAND2-AS1在体内抑制宫颈癌发展 3.WT1-AS通过SPI1调控PIK3AP1介导宫颈癌细胞自噬和凋亡 ①lncRNA WT1-AS在宫颈癌中表达下降 ②WT1-AS促进PIK3AP1的表达 ③WT1-AS调控宫颈癌细胞自噬与凋亡 ④WT1-AS通过PIK3AP1调控宫颈癌发生 ⑤WT1-AS在体内抑制宫颈癌发展 三、文献示例 1.文章思路 2.lncRNA在细胞高表达-实验内容 3.lncRNA在维持干细胞特性-实验内容 4.lncRNA调节的下游基因及通路-实验内容 5.lncTCF7-转录因子调控示意图 一、转录因子定义与分类 1.转录因子定义 与基因5`端特定序列专一性结合，调节基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质。 （1）在核内发挥作用的蛋白质； （2）每一个转录因子识别特异的核酸序列； （3）调节DNA向RNA 转录过程。 2.常见转录因子（TF）类型 （1）构成型TF： 普遍一直存在.结合基因启动子调控基因转录，Sp1, NF1等。 （2）条件型TF： ① 发育型TF，表达受到严格控制，一旦表达即具有活性， 如GATA. HNF.PIT-1.MyoD.Myf5. Hox. Winged Helix等。 ② 通路依赖性TF，调控活性依赖于细胞内通路活化发挥作用， 如SREBP. p53.CREB.AP-1.Mef2.STAT.R-SMAD. NF-κB,.Notch.TUBBY.NFAT等。 3.lncRNA-转录因子调控模式 二、实验设计思路设计方向和设计框架 1.实验课题设计思路 （1）实验课题设计思路-lncRNA研究 （2）实验课题设计思路-lncRNA表达与特征 ① 被研究过 A.生信分析lncRNA可能参与被研究过程； B.PCR验证在临床表达变化； C.临床相关性分析； D.表达与生存分析； E.细胞系内表达验证。 ② 全新 A.生信分析lncRNA参与被研究过程； B.lncRNA特征分析； C.lncRNA基因组定位示意图.保守性分析； D.RACE验证lncRNA全长及TSS.验证表达特异性； E.FISH验证lncRNA亚细胞定位； F.PCR验证在临床及细胞系表达.表达与生存分析。 （3）实验课题设计思路-lncRNA调控基因 ① PCR.IHC.WB或IF等检测临床样本靶基因表达；生信分析lncRAN可能的靶基因； ② RNA pull-down验证lncRNA结合基因启动子；双荧光素酶验证lncRNA调控启动子活性； ③ 沉默lncRNA，PCR.WB.IF检测基因表达；过表达lncRNA，PCR.WB.IF检测基因表达； ④ 沉默lncRNA，PCR检测沉默效率以及基因表达， 沉默lncRNA，检测基因调控的功能：如增殖.凋亡.迁移.自噬.分化.通路活化等； ⑤ 过表达lncRNA，PCR检测过表达效率及基因表达， 过表达lncRNA，检测检测基因调控的功能； ⑥ 设置拯救实验，如沉默lncRNA+沉默基因，沉默lncRNA+过表达基因，过表达lncRNA+过表达基因，过表达lncRNA+沉默基因；检测基因下游功能。 （4）实验课题设计思路-lncRNA通过转录因子调控基因 ①生信分析lncRNA可结合的转录因子； RNA pull-down.RIP检测lncRNA结合的转录因子； CHIP检测临床样本基因启动子区转录因子募集。 ②过表达lncRNA+沉默转录因子，检测基因表达及下游功能变化； 过表达lncRNA+其他破坏该转录因子结合.功能的处理，检测基因表达及下游功能。 （5）实验课题设计思路-lncRNA.基因体内功能 ①转染过表达lncRNA.si-lncRNA.rescue的细胞接种裸鼠，检测成瘤指标.转移指标； ②收集肿瘤指标，ICH.FISH检测肿瘤内lncRNA及基因表达。 2.HAND2-AS1通过E2F4调控C16orf74介导宫颈癌发展 向上滑动查看 框架设计 ① lncRNA HAND2-AS1在宫颈癌中表达下降 A.芯片数据发现HAND2-AS1在宫颈癌中表达降低; B.TCGA结果展示HAND2-AS1与宫颈癌相关性; C.示意图展示HAND2-AS1的基因组定位(UCSC数据); D.病人样本与正常对照,PCR检测HAND2-AS1表达; E.病人样本进行FISH检测HAND2-AS1表达定位; F.宫颈癌细胞株与正常细胞比较,PCR检测HAND2-AS1表达。 ② HAND2-AS1抑制C16orf74的表达 A.生信分析HAND2-AS1可结合的蛋白质,得到E2F4结合较强; B.生信分析发现HAND2-AS1与E2F4蛋白及C16orf74 DNA形成复合物; C.RNA pull-down检测HAND2-AS1可结合E2F4; D.RIP检测HAND2-AS1可结合E2F4; E.对病人样本以及宫颈癌细胞株进行CHIP,检测到C16orf74基因启动子区可结合HAND2-AS1且较正常组下降; F.双荧光素酶实验检测HAND2-AS1可调控HAND2-AS1启动子活性; G.正常宫颈上皮细胞si- HAND2-AS1,与si-Ctrl比较,检测C16orf74的mRNA及蛋白质表达; H.宫颈癌细胞过表达HAND2-AS1,与vector比较,检测C16orf74的蛋白质及mRNA表达。
③ HAND2-AS1抑制宫颈癌细胞增殖迁移 A.宫颈癌细胞过表达HAND2-AS1,与vector组比较,检测细胞增殖/迁移/侵袭/克隆形成等; B.正常细胞si- HAND2-AS1,与si-Ctrl相比,检测细胞增殖/凋亡; C.宫颈癌细胞过表达HAND2-AS1+过表达C16orf74, 检测细胞增殖/迁移/侵袭。
④ HAND2-AS1通过C16orf74/ PPP3CA调控宫颈癌发生 A.生信预测+文献引用说明C16orf74与PPP3CA存在相互作用(https:///135663); B.Co-IP检测C16orf74与PPP3CA相互作用; C.IF染色检测C16orf74与PPP3CA共定位; D.宫颈癌细胞转染si-PPP3CA,与Ctrl比较检测细胞增殖/凋亡; E.正常细胞si-HAND2-AS1, 采用PPP3CA抑制剂或溶剂对照处理,检测细胞增殖凋亡。
⑤ HAND2-AS1在体内抑制宫颈癌发展 A.构建稳转荧光素酶宫颈癌细胞株,分别转染si-HAND2-AS1.OE-HNAD2-AS1, si-HAND2-AS1+si-C16orf74，以及对照，检测转染效率后，接种裸鼠，生物发光检测肿瘤大小.转移； B.对裸鼠实体瘤进行IHC，检测C16orf74的表达以及与PPP3CA的定位。 3.WT1-AS通过SPI1调控PIK3AP1介导宫颈癌细胞自噬和凋亡 向上滑动查看 ① lncRNA WT1-AS在宫颈癌中表达下降 A.芯片数据发现WT1-AS在宫颈癌中表达降低; B.T.CGA结果展示WT1-AS与宫颈癌相关性; C.病人样本与正常对照,PCR检测WT1-AS表达; D.病人样本进行FISH检测WT1-AS表达定位; E.宫颈癌细胞株与正常细胞比较,PCR检测WT1-AS表达。
② WT1-AS促进PIK3AP1的表达 A.生信分析WT1-AS可结合的蛋白质,得到SPI1结合较强; B.生信分析发现WT1-AS与spi1蛋白及PIK3AP1 DNA形成复合物; C.RNA pull-down检测WT1-AS可结合SPI1; D.RIP检测WT1-AS可结合SPI1; E.对病人样本以及宫颈癌细胞株进行CHIP,检测到PIK3AP1基因启动子区可结合WT1-AS且较正常组下降; F.宫颈癌组织与正常组织比较，检测PIK3AP1的表达下降； G.双荧光素酶实验检测WT1-AS可促进PIK3AP1启动子活性; H.正常宫颈上皮细胞si- WT1-AS,与si-Ctrl比较,检测PIK3AP1的mRNA及蛋白质表达; I.宫颈癌细胞过表达WT1-AS,与vector比较,检测PIK3AP1的蛋白质及mRNA表达。
③ WT1-AS调控宫颈癌细胞自噬与凋亡 A.宫颈癌细胞过表达WT1-AS,与vector组比较,检测细胞增殖/自噬/克隆形成等; B.正常细胞si- WT1-AS,与si-Ctrl相比,检测细胞自噬与凋亡; C.宫颈癌细胞过表达WT1-AS+si-SPI1, 检测细胞自噬凋亡。
④ WT1-AS通过PIK3AP1调控宫颈癌发生 A.正常细胞转染si-WT1-AS, CHIP检测PIK3AP1启动子区SPI1结合减少，以及SPI1表达下降，并检测细胞增殖凋亡; B.宫颈癌细胞转染OE-PIK3AP1,与Ctrl比较检测PIK3AP1启动子区SPI1结合增加，检测PIK3AP1表达，并检测细胞自噬凋亡; C.宫颈癌细胞OE-WT1-AS+si-PIK3AP1,检测细胞凋亡自噬。
⑤ WT1-AS在体内抑制宫颈癌发展 A.构建稳转荧光素酶宫颈癌细胞株,分别转染si- WT1-AS.OE- WT1-AS, OE- WT1-AS +si-C16orf74，以及对照，检测转染效率后，接种裸鼠，生物发光检测肿瘤大小； B.对裸鼠实体瘤进行IHC，检测PIK3AP1的表达。 三、文献示例思路解析实验设计内容 lncTCF7将转录因子SWI/SNF复合物招募至TCF7启动子处调控了它的表达，导致了Wnt信号激活促进了肝癌干细胞自我更新和肿瘤增殖。 1.文章思路 ① LncTCF7 在肝癌干细胞高度表达； ② LncTCF7维持肝癌干细胞特征； ③ LncTCF7启动TCF7的表达,激活Wnt通路； ④ LncTCF7募集SWI/SNF 调控TCF7 表达。 2.lncRNA在细胞高表达-实验内容 ① 在三株肝癌细胞系中分离出HCC干细胞，通过芯片的方法找到差异lncRNA； ② 在数据库中可以找到lncTCF7的序列，RACE将lncTCF7序列扩增出来； ③ RT-PCR检验芯片的数据和实验数据是否一致。 3.lncRNA在维持干细胞特性-实验内容 ① 干扰lncTCF7的序列，检测肝癌细胞克隆形成能力和干扰lncTCF7在总细胞中所占的比例降低； ② 体外表达实验证明lncTCF7不能生成蛋白； ③ 过表达lncTCF7后，检测肝癌细胞克隆形成能力； ④ 干扰lncTCF7后检测干细胞在总细胞中所占的比例； ⑤ 验证分子机制，注意进行干扰和过表达的双向验证。 4.lncRNA调节的下游基因及通路-实验内容 ① 通过RNA-SEQ分析干扰LncTCF7前后基因的表达情况； ② 通过RT-PCR以及WB的方法发现主要影响的信号通路； ③ RNA-pull down 用LncTCF7的正向序列和反向序列，然后通过电泳和质谱，找到正义链特异性结合的蛋白质； ④ 通过质谱和WB确定LncTCF7结合的主要转录因子； ⑤ 通过LncTCF7截短体实验，得到LncTCF7的转录因子结合区域； ⑥ EMSA进一步验证LncTCF7可以和三个转录因子结合； ⑦ 验证干扰转录因子后细胞表型。 5.lncTCF7-转录因子调控示意图 |
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