通过CAR-T细胞靶向递送PD-1阻断性scFv增强体内抗肿瘤功效

概述 

通过与免疫检查点阻断抑制剂组合，可以增强嵌合抗原受体CAR-T细胞治疗对不敏感肿瘤的功效。或者，CAR-T细胞结构被设计成，在肿瘤微环境中可共同表达促进CAR-T细胞功能的因子。我们修改CAR-T细胞以分泌PD-1阻断单链可变片段（scFv）。这些分泌scfv的CAR-T细胞在PD-L1⁺血液学和实体肿瘤的临床相关同系和异系小鼠模型中，均以旁分泌和自分泌的方式发挥作用，提高CAR-T细胞和旁观者肿瘤特异性T细胞的抗肿瘤活性。其疗效与CAR-T细胞和检查点抑制剂联合治疗相似或更好。这种方法可以提高安全性，因为分泌的scFv仍然可定位于肿瘤，保护CAR-T细胞免受PD-1抑制，这可能潜在地避免与全身检查点抑制相关的毒性。

可以通过CAR的表达将T细胞导向靶肿瘤细胞。 CAR是由细胞外抗原识别结构域组成的合成受体，其最常见的是scFv，但也可以采用任何抗原结合肽的形式。这个结合域与细胞内T细胞激活和共同刺激域相连，不管有没有铰链域。尽管CAR-T细胞疗法已经在B细胞急性淋巴细胞白血病患者中显示出显着的效果，但其治疗其他血液和实体肿瘤的效果却不那么明显。

这些不明显的情况可能与肿瘤微环境（TME）有关。当输注到患者体内时，CAR-T细胞经常遇到抑制性肿瘤微环境，细胞和抑制性配体可以与T细胞上的抑制性受体结合并阻碍T细胞的抗肿瘤反应。例如，在卵巢癌中，已经发现免疫抑制的m2 -极化肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和调节性T (Treg)细胞存在于肿瘤微环境中，这些细胞的存在与肿瘤浸润淋巴细胞减少和患者预后不良有关。 TAM和Treg细胞均通过接触和细胞因子介导的机制抑制浸润的T细胞。此外，在激活后，T细胞分泌IFN-γ，一种已显示可在临床和临床前模型中动态上调卵巢癌细胞上的程序性死亡配体-1（PD-L1）表达的细胞因子。 PD-L1与T细胞上的抑制性受体程序性死亡1（PD-1）结合并抑制T细胞功能。通过CRISPR介导的卵巢癌细胞上PD-L1的缺失中断PD-1 / PD-L1连接，改善了过继转移的第二代CAR-T细胞在临床前模型中的功效。这些因素可能导致CAR-T细胞缺乏这种实体肿瘤恶性肿瘤的临床疗效。

使用抗体破坏T细胞上抑制性受体之间的相互作用，特别是CTLA-4和PD-1，以及它们对肿瘤细胞的抑制性配体的检查点阻滞疗法已经在一系列实体瘤和血液系统恶性肿瘤患者中产生了临床反应。检查点阻断疗法的功效的相关性包括T细胞活化标记物，PD-L1的肿瘤细胞表达，肿瘤中预先存在的CD8 + T细胞浸润和肿瘤突变负荷。综上所述，这些结果表明肿瘤特异性T细胞是检查点阻断作用的一个完整机制，而对已有肿瘤特异性T细胞的重新介入对于这种治疗方式的成功至关重要。

我们之前描述过“武装”CAR-T细胞，它们是CAR-T细胞，经过共同修饰以表达免疫调节配体如CD40L或分泌细胞因子如IL-12或IL-18以增强CAR-T细胞在肿瘤微环境中起作用。基于我们之前的发现，我们没有将CAR-T细胞与现有的系统性检查点封锁抗体治疗结合起来，而是像之前在临床前模型中研究的那样，我们试图使用武装CAR-T细胞平台来创建一种单一的治疗方法，在这种治疗中CAR-T细胞分泌免疫检查点封锁scFv。鉴于CAR-T细胞向肿瘤输送，PD-1阻断性scFv将被局部递送至疾病部位，从而最小化与免疫检查点阻断相关的毒性。我们发现分泌PD-1阻断scFv的CAR-T细胞通过自分泌和旁分泌机制增强了同源和异种小鼠模型中PD-L1 +荷瘤小鼠的存活。该策略有可能增强CAR-T细胞疗法在具有免疫抑制性肿瘤微环境的癌症中的功效。

结论 

修饰小鼠CAR-T细胞以分泌抗小鼠PD-1的scFv

为了测试我们在免疫活性同系小鼠模型中的方法，我们生成了逆转录病毒第二代CAR构建体，其含有的结合域可识别CD19或MUC16（MUC16^ecto）和小鼠CD28和CD3 zeta T细胞信号传导结构域的保留部分。常规CAR分别标记为19m28mZ或4H11m28mZ。 装甲小鼠CAR构建体，标记为19m28mZ / RMP1-14或4H11m28mZ / RMP1-14，使用相同的骨架，结合域和小鼠信号传导结构域作为第二代小鼠CAR，并且还共同修饰以包括c-myc标记的，衍生自抗小鼠PD-1阻断单克隆抗体（mAb），RMP1-14的可变重链和轻链的scFv。通过转导原代小鼠T细胞以表达CAR构建体并分泌RMP1-14 scFv。

我们将暴露于IFN-γ后上调PD-L1的表达人CD19的小鼠淋巴瘤EL4细胞（hCD19 mPD-L1）或表达MUC16^ecto的卵巢肿瘤ID8细胞与分泌scFv的CAR-T细胞共同培养。 当与肿瘤靶标一起培养时，常规和分泌RMP1-14 scFv的CAR-T细胞被特异性裂解并产生IFN-γ。

我们接下来评估了分泌的RMP1-14 scFv与PD-1的结合。 与修饰为19m28mZ的细胞相比，19m28mZ / RMP1-14T细胞上表面PD-1的量显着减少（P = 0.01），这与自分泌scFvs的CAR-T细胞结果一致。细胞。 为了确定scFv是否与旁观者PD-1表达细胞结合，我们在孔板的底部培养4H11m28mZ T细胞，顶部分别培养19m28mZ和19m28mZ / RMP1-14细胞。 24小时后，我们检测到与19m28mZ / RMP1-14细胞共培养的4H11m28mZ细胞表面PD-1水平低于与19m28mZ T细胞共培养的细胞（P = 0.04），与分泌的scFvs与旁观者细胞的结合一致。

 

CAR-T细胞在体内分泌阻断PD-1的scFv

我们接下来验证了肿瘤微环境中CAR-T细胞分泌的PD-1阻断性scFv的存在。将可触知腹水的荷瘤小鼠腹腔注射CAR-T细胞。48小时后收获这些小鼠的腹水，用anti-myc-tag抗体的免疫沉淀检测和western blot分析，可检测到通过4H11m28mZ / RMP1-14T细胞分泌的RMP1-14 scFvs。

我们接下来测试了分泌scFv的CAR-T细胞在转移性卵巢癌的同系免疫能力小鼠模型中的功效。将C57BL/6小鼠腹腔注射ID8细胞，7天后注射CAR-T细胞。4H11m28mZ/RMP1-14 T细胞与使用4H11m28mZ (P = 0.004)和使用19m28mZ/RMP1-14 T细胞对照(P = 0.0006)的小鼠相比，存活率有所提高。使用4H11m28mZ/RMP1-14 T细胞或4H11m28mZ T细胞+ RMP1-14抗体治疗，均显示了类似的生存益处(P = 0.051)。单独用RMP1-14mAb处理的荷瘤小鼠与用对照CAR-T细胞处理的小鼠相比没有存活益处。

PD-1与PD-L1结合可导致T细胞衰竭、无反应和/或凋亡。我们发现，使用4H11m28mZ/RMP1-14 T细胞或4H11m28mZ T细胞+ RMP1-14抗体治疗的长期存活小鼠，在肿瘤接种后120 天，可在骨髓中通过PCR检测到CAR-T细胞。此外，与原始未治疗的小鼠相比，当用初始剂量的ID8肿瘤细胞再次攻击时，4H11m28mZ / RMP1-14处理的小鼠能够产生抗肿瘤反应（P <>

我们假设分泌pd -1阻断scFvs的CAR-T细胞可以重新激活内源性肿瘤特异性T细胞。为了验证这一点，我们在C57BL/6小鼠皮下注射免疫原性黑色素瘤细胞株B16-F10。这些小鼠对肿瘤产生内源性反应，但无法根除。从用4H11m28mZ / RMP1-14 CAR-T细胞瘤内处理的小鼠中分离的内源性旁观者肿瘤浸润淋巴细胞表达的CD80，CD107α，IFN-γ和颗粒酶B水平显着高于用4H11m28mZ处理的（P <>

 

人pd -1阻断scFv E27的选择

从人scFv噬菌体展示文库（Eureka Therapeutics）中分离到人PD-1阻断scFv E23，E26和E27。 与PD-1结合的三种候选物E23，E26和E27的解离常数（KD）分别为8.3,6.3和3.6nM。 E23，E26和E27抗体能够以剂量依赖性方式阻断PD-1与PD-L1的结合。收集被病毒转导的相同数量细胞的上清液，可检测到抗PD1可分泌的scFv。克隆E27的条带最强，说明scFv在上清中最稳定。因此，我们在后续的研究中使用了E27。

修饰人CAR-T细胞以分泌抗人PD-1阻断scFv

我们产生了编码CD19-或MUC16ecto-靶向CAR和His / HA-标记的E27 scFv的人CAR构建体（分别为1928z-E27和4H1128z-E27）。 转导的T细胞在表面上表达CAR并分泌E27 scFv。在1928z-E27 T细胞的上清液中孵育后，通过HA-tag检测293Glv9-PD1+细胞，证实了E27与PD-1的结合。此外，我们在1928z-E27和4H1128z-E27 T细胞上检测到的PD-1低于修饰后表达1928z或4H1128z的细胞，这与E27 scFv与T细胞PD-1的结合一致。我们在肿瘤细胞的背景下证实了CAR-T细胞的抗原依赖性裂解。

我们转导Raji和NALM6肿瘤细胞以表达PD-L1，并与Raji-PD-L1或NALM6-PD-L1在1:1肿瘤:CAR-T细胞比例下共培养1928z和1928z- e27 T。共培养72h后，采用流式细胞术检测剩余肿瘤细胞。可发现1928z-E27 T细胞比1928z T细胞裂解更多的Raji-PDL1和NALM6-PDL1肿瘤细胞。使用该测定法，我们发现与1918z T细胞相比，与Raji-PDL1或NALM-PDL1肿瘤共培养后，1928z-E27 T细胞的扩增增加，与1928z-E27 T细胞对PD-L1介导抑制的反应一致。与Raji-PD-L1共培养后，1928z-E27细胞的表面PD-1检测水平低于1928z T细胞，这可通过阳性细胞百分比和染色的平均荧光强度来确定。

E27与旁观者细胞结合

为了证明未转导的旁观者细胞可以从附近的CAR-T细胞分泌的E27 scFv中受益，我们首先将健康的人供体T细胞与1928z或1928z-E27 CAR-T细胞共培养，并通过抗cd3和抗cd28微珠刺激细胞。共培养4天后，分选CAR +和CAR-的T细胞，并通过western blot分析显示，在与1928z-E27/PD-1 T细胞共培养时，E27可同时结合CAR+和CAR-细胞上的PD-1，但在与1928z/PD-1 T细胞共培养时并没有出现。

分别在1928z和1928z- e27 T细胞中培养3t3或3T3-PDL1细胞，并用抗cd3和抗cd28小珠刺激细胞。与培养于3T3-PDL1细胞的1928z T细胞相比，培养于3T3细胞的1928z T细胞增殖增强。然而，1928z-E27 T细胞与3T3和3T3-PDL1培养时，表现出的扩增情况相似。

当用3T3细胞培养时，1928z和1928z-E27T细胞的扩增没有显着差异（P = 0.063）。在第12天，3T3-PDL1培养的1928z T细胞与3t3 培养的细胞相比，细胞数量明显减少。我们预计CAR +和CAR-细胞的群体将在这种情况下以相似的比例收缩，并且总体CAR +百分比将相对于时间0保持相同。这是我们在计算CAR +细胞相对于时间0时观察到的情况。然而，因为与3T3-PDL1细胞一起培养的1928z-E27细胞在第12天显着扩增，可以预期CAR +细胞的总数将增加，从而导致CAR +细胞的百分比增加。如果阻断PD-1的scFv仅赋予分泌它的细胞选择性增殖优势，则情况就是这样。然而，在3T3-PDL1细胞扩增后的CAR+ 1928z-E27 T细胞的比例在第12天与第0天相比没有增加，说明在PD-L1环境下，E27 scFv同时保护了转化的T细胞扩增和未转化的旁观者细胞的扩增。

 

分泌E27 scFv的CAR-T细胞在体内具有增强的抗肿瘤功能

我们通过静脉注射Raji-PDL1或NALM6-PDL1肿瘤细胞给SCID/ Beige小鼠接种，来测定分泌E27的CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效。1与输注1928z T细胞相比，输注1928z-E27 T细胞显着增强了Raji-PDL1（P = 0.03）和NALM6-PDL1（P = 0.01）荷瘤小鼠的存活率。

接下来，我们研究了分泌E27的CAR-T细胞在腹膜癌的实体瘤模型中的抗肿瘤功效。与用4H1128z T细胞处理的小鼠相比，用4H1128z-E27T细胞处理的携带SKOV3-PDL1肿瘤的SCID / Beige小鼠的存活率提高（P = 0.02）。 此外，使用这种转移性卵巢肿瘤的临床前异种移植模型，用分泌E27 scFv 的4H1128z T细胞治疗的小鼠比用4H1128z T细胞+抗人PD-1 单克隆抗体治疗的小鼠存活率更高（P = 0.048）。

为了在体内证明分泌E27的CAR-T细胞的旁观者效应，我们用抗原无关的1928z-E27和肿瘤特异性4H1128z CAR-T细胞的组合处理携带SKOV3-PD-L1的小鼠。 在该实验模型中，仅抗原不相关的CAR-T细胞表达PD-1阻断性scFv，并且仅用1928z-E27 T细胞处理没有存活益处。 然而，与仅用4H1128z T细胞处理的小鼠相比，当一起注射时，1928z-E27增强了第二代4H1128z细胞的抗肿瘤功能（P = 0.03）。 该结果表明，1928z-E27细胞分泌的E27 scFv在体内与旁观者肿瘤特异性细胞结合。

 

CAR-T细胞分泌的E27 scFv仅在肿瘤微环境局部检测到

使用SKOV3腹膜癌病的实体肿瘤模型，我们试图确定CAR分泌的scFv的局部和全身水平。首先，当腹膜内给药时，我们利用体内生物发光和荧光成像来观察scFv或单克隆抗体的位置随时间推移的变化。使用与Gaussia Luciferase（GLuc）酶融合的E27 scFv产生CAR构建体，在CAR-T细胞分泌E27后，可不依赖于ATP信号并成像显示E27在体内的位置。我们将一种商业化的抗人PD-1单克隆抗体与680 XL荧光色素结合。将分泌E27-GLuc或CAR-T细胞和荧光标记的单克隆抗体的CAR-T细胞注射到荷瘤小鼠体内并随时间成像。最早在3h时，该抗体可在小鼠体内系统性发现，而scFv仅在腹腔内检测到。定量后，我们没有观察到E27的全身和局部量之间的差异，因为E27仍然位于肿瘤部位。然而，我们发现标记的商业抗体水平发生变化，因为它似乎在肿瘤区域外循环。

我们使用高分辨率的四极质谱仪 orbitrap仪器来进一步量化抗体或scFv随着时间的变化。我们对SCID / Beige小鼠腹腔注射了卵巢癌SKOV3肿瘤细胞，7天后，腹腔注射分泌E27的CAR-T细胞或抗体和CAR-T。我们随时间收集血清样品并进行靶向平行反应监测光谱测定以量化E27或商业抗体随时间的数量变化。使用了两种独特的胰蛋白酶肽，它们来自于scFv和单克隆抗体的互补区，在其他小鼠或人类蛋白中不存在。在血清中系统性检测到商业pd -1阻断单抗，并随着时间的推移呈下降趋势。然而，我们没有在血清中任何时间点检测到E27，这表明它仍然局限于TME。静脉内注射由分离的scFv组成的对照样品。证明我们的测定法能够检测外周血清中的E27。重要的是要注意抗体和scFv分子的稳定性和半衰期不同，这可能影响我们检测血清中scFv的能力。然而，考虑到我们发现scFv可在全身输注后30分钟检测到，并且在我们的系统中，scFv由CAR T细胞在体内组成型生成，如果它存在于外周，我们应该能够检测CAR -T-细胞衍生的E27。此外，如果scFv的稳定性和半衰期不允许其离开局部肿瘤微环境并在外周检测到，这进一步推动了我们的假设，即使用scFv的局部检查点阻断可能是抗体的更安全的替代方案。这些结果表明，与检查点阻断单抗不同，CAR-T细胞分泌的E27不是全身存在的。

 

讨论

通过多种体内模型，我们证明了分泌PD-1阻断scFv的CAR-T细胞，可增强同源和临床前异种血液学和实体肿瘤模型中小鼠的存活率。 分泌PD-1阻断性scFv的CAR-T细胞具有相同效果或更优于用CAR-T细胞和PD-1阻断性单抗的治疗，表明PD-1阻断的局部递送在增强CAR-T细胞抗肿瘤方面是有效的。PD-1阻断的CAR-T细胞治疗的长生存期的小鼠，可以在小鼠的骨髓中检测到CAR-T细胞，并且，当肿瘤再次攻击时产生抗肿瘤反应。由CAR-T细胞产生的PD-1阻断性scFv可以在肿瘤微环境中增强体内肿瘤特异性旁观者T细胞的功能。 最后，与全身检查点阻断疗法不同，CAR-T细胞分泌的scFv仅保留在肿瘤微环境的局部。

前期临床研究表明，CAR-T细胞易受PD-1受体介导的抑制效应功能的影响，并随后与PD-1/ pdl -1阻断抗体联合使用(外源或CAR-T细胞产生)，导致CAR-T细胞介导的抗肿瘤反应增强。然而，这些研究局限于异种移植模型，这些模型不能重现内源性免疫抑制TME，并且没有证明旁观者效应或抗体的局部递送。具体而言，先前的研究使用分泌抗体（不是scFv）的CAR-T细胞，并且没有将其与单独的抗体或CAR-T细胞和全身抗体进行比较;因此，他们的方法是否优于既定疗法尚不清楚。ScFvs是比抗体更小，更不稳定的分子，并且没有用它们证明成功的检查点阻断。此外，较小尺寸的scFv使得能够设计较小的CAR构建体，从而允许将来具有scFv组合的三顺反子载体的可能性。

预防与PD-1相关的CAR-T细胞应答抑制的替代方法包括共表达嵌合转换受体，PD-1的细胞外结构域与激活信号结构域连接，或共修饰CAR-T细胞以表达 显性负性PD-1受体。 与仅表达CAR的T细胞相比，这两种方法均能提高PD-L1+肿瘤靶细胞的细胞溶解、细胞因子分泌水平，并增强体内抗肿瘤作用。然而，这种保护作用仅限于CAR-T细胞本身。肿瘤微环境中的内源性肿瘤浸润淋巴细胞仍然受到PD-1介导的抑制。鉴于CAR-T细胞分泌的pd -1阻断scFvs能够与旁观者细胞结合，我们推测本文描述的pd -1阻断scFvs局部分泌可能保护内源性抗肿瘤免疫细胞，减少抗原阴性肿瘤的生长。

检查点阻滞的全身给药可导致免疫相关不良事件（IRAEs）。 IRAEs在接受检查点封锁治疗的患者中很常见。 鉴于CAR-T细胞在肿瘤部位传输和扩张，PD-1阻断性scFv的递送主要定位于我们模型中的这些区域。 因此，我们假设我们的策略，展示局部而不是系统的传递，可能会减少与系统检查点封锁相关的IRAEs。

我们的结果验证了CAR-T细胞可以在无系统阻断的情况下将免疫调节scFvs传递给肿瘤微环境的观点。随着人类噬菌体展示文库的快速发展，利用scFvs靶向其他分子，如lag3、TIM-3或CLTA-4，以及组合策略，扩展这种免疫调节CAR-T细胞方法是可行的。装甲CAR-T细胞靶向向肿瘤微环境输送免疫调节scFvs，可提高CAR-T细胞及检查点封锁治疗的临床疗效。