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文章题目：Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral BloodLymphocytes and Tumor Organoids 研究人员：荷兰王国阿姆斯特丹的癌症治疗中心等 发表时间：2018. 08 期刊名称：Cell 影响因子：31.398研究亮点 大量的临床试验已经证实癌症免疫疗法对部分上皮癌患者有明显疗效，然而，目前还没有一个专门研究癌症患者与自身T细胞相互作用的技术平台。什么是引起癌症免疫响应的决定因素？科学家们对这个问题还缺乏了解。本文作者搭建了一个平台，试图观察以个性化方式诱导获得的肿瘤特异性T细胞对上皮癌的反应。作者实验证明了对于错配修复缺陷直肠癌和非小细胞肺癌患者，自体肿瘤类器官和外周血淋巴细胞的共同培养可以丰富外周血中的肿瘤应答T细胞；此外，作者还证明了，这些T细胞可以评估杀伤相应肿瘤的效率。这个平台提供了一种临床可行的分离肿瘤应答T细胞的方法，同时，它可以用来评估不同患者的肿瘤细胞对T细胞介导的免疫攻击的敏感性。 研究背景 针对免疫检查点使用抗体，如CTLA-4和PD-1/PD-L1，对于部分癌症的晚期患者，如黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）以及错配修复缺陷直肠癌（dMMR CRC）等，有明显的临床益处。此外，体外扩张的自体肿瘤浸润淋巴细胞在黑色素瘤和早期宫颈癌的治疗中也展现了可观的临床反应。然而，尽管有这些振奋人心的结果，目前的免疫疗法对大部分患者是无效的。这种治疗无效的原因是多方面的，包括免疫原性抗原的数量过低、抗原的呈现有缺陷，以及存在可替代的免疫检查点分子表达等。鉴于癌症的免疫规避机制多种多样，目前很难预测某个病人是否对免疫疗法敏感，哪种机制可能导致抗药性，以及哪种替代疗法可能克服抗药性。 如果有一个平台能够根据不同患者的情况，准确并系统性地分析患者体内T细胞介导的肿瘤识别，科学家们就能更好地了解实现抗肿瘤免疫反应的关键因素。从前，分析T细胞和肿瘤相互作用的体外系统大多都用于皮肤黑色素瘤的研究和治疗上。一方面，这是因为利用体外系统扩大的肿瘤浸润T细胞已经被证实能有效地治疗皮肤黑色素瘤；另一方面，也是因为黑色素瘤细胞系的获取相对来说比较容易。随着免疫疗法广泛地发展和应用在上皮癌的临床治疗中，开发一个新的技术平台来深入了解T细胞介导的肿瘤识别变得至关重要。这项研究通常受到两方面的限制：一，很难确定上皮癌的原发肿瘤细胞系（成功率为10%甚至更低）；二，获得匹配的具有肿瘤反应的T细胞群的可能性较低。 因此，作者们开始思考建立一个自体T细胞肿瘤类器官共培养平台的可行性。肿瘤类器官，是一种三维原发性肿瘤细胞培养物，它保留了原始肿瘤的组织学和突变特征。科学家可以通过肿瘤切除手术或者转移瘤的穿刺活检来培养肿瘤类器官。科学家们希望通过研究，确定两个问题：一，肿瘤特异性应答T细胞是否能通过外周血淋巴细胞(PBLs)和相应的肿瘤类器官的共同培养得到；二，通过这种方式得到的T细胞能否用于评估杀伤肿瘤细胞的效率性。如果这一方法被证实是有效的，科学家将不再困扰于如何确定上皮癌的原发肿瘤细胞系，外周血淋巴细胞也将会替代肿瘤浸润淋巴细胞，成为一种更易获取的肿瘤应答T细胞的来源。 研究成果 1.培养错配修复缺陷直肠癌（dMMR CRC）类器官 本文作者们将研究重点放在dMMRCRC上，因为这种肿瘤具有高突变负荷的特性，并且能够频繁地应答抗PD-1治疗。为了评估肿瘤应答T细胞能否通过外周血和自体肿瘤类器官得到富集，作者收集了数名CRC患者的血液样本和肿瘤组织，用标本切除或穿刺活检得到的新鲜肿瘤组织来培养肿瘤类器官。根据以往的数据，通过这种方式成功培养出肿瘤类器官的概率是60%。 作者使用13名患者的肿瘤细胞培养了15个肿瘤类器官，这些类器官与原始肿瘤在形态上十分相似(图1A）。全外显子测序的结果显示，这些肿瘤类器官都具有高突变负荷，突变数目的范围在795~2877之间，这与科学家们之前关于CRC的研究相吻合（图1B ）。同时，作者们在这些肿瘤类器官中找到了典型的CRC相关突变。这些都证实了，肿瘤类器官保留了原始肿瘤的组织学和突变特征，能够替代肿瘤细胞应用于后续的研究中。 图一 （A）肿瘤类器官和肿瘤切片的对比 （B）肿瘤类器官的突变数目 2. 自体肿瘤类器官共培养，诱导循环T细胞的肿瘤应答 为了检测肿瘤类器官是否能用于肿瘤应答T细胞的获取，作者们设计了一个方案，用来自同一患者的外周血细胞和肿瘤类器官共培育肿瘤应答T细胞。在进行共培育之前，研究员使用IFNγ预先刺激肿瘤类器官，将其染色，以增强抗原呈现。然而，IFNγ的添加会诱导肿瘤细胞上PD-L1的生成，当PD-L1与T细胞上的PD-1结合时，T细胞的活性受到抑制。因此，为了中和这种抑制效果，研究员在外周血细胞中加入了抑制PD-1的抗体。另外，还加入了抗CD28和IL-2，分别用于T细胞的共刺激和增殖。研究员每周用新鲜的肿瘤细胞刺激外周血淋巴细胞。两周后，通过染色IFNγ和脱粒标志物CD107a的数量来衡量CD8+T细胞的肿瘤识别能力（图2）。 图二 肿瘤类器官与外周血淋巴细胞的共培育 在8例样品中，有4例在经过两周的自体肿瘤类器官共培养后，IFNγ和CD107a同时呈现表达上调（图三），这说明肿瘤应答T细胞的数量有所增加。其中，编号为CRC-9的样本，大约有50%的CD8+T细胞有肿瘤反应。如此高的反应性可能是因为该患者的外周血淋巴细胞内原本就存在能够产生肿瘤应答的T细胞群。对此，研究员测量了，在共培育之前，CRC-9的外周血T细胞的肿瘤反应性。结论表明，相当多的CD8+T细胞在那时就已经表现出肿瘤反应性，而肿瘤类器官的共培育使得这些T细胞的数量在两周内扩大了十倍。相反地，有一些样本，如CRC-11、CRC-12和CRC-13，在未进行共培育之前，并没有表现出任何肿瘤反应性。然而经过两周的共培育后，出现了少量可繁殖的肿瘤应答T细胞。这证明这个肿瘤应答T细胞的共培育系统也适用于那些原本没有发现肿瘤应答的T细胞群。 图三 T细胞和肿瘤类器官共培育 vs T细胞单独培育 3.类器官应答T细胞的特异性 上述实验证明，通过这个系统，我们可以培育出对类器官产生应答的T细胞。然而，这种T细胞应答是源于肿瘤本身的特异性，还是在培育过程中被人为制造的呢？在之前的实验里，肿瘤类器官加入了IFNγ，为了证明肿瘤类器官的T细胞应答与IFNγ无关，研究员设计了一个对比实验。其中，一组使用IFNγ预先刺激肿瘤类器官，而另一组肿瘤类器官没有经过任何处理。分别使用它们对外周血淋巴细胞进行刺激，对比两组T细胞的活性标志CD137的表达量。结果表明，两组T细胞对肿瘤细胞的反应十分接近（图四），IFNγ的添加并不会影响肿瘤类器官引导的T细胞应答。 为了更直接地判断T细胞应答是否存在肿瘤抗体特异性，作者又测试了T细胞是否会对患者体细胞类器官做出反应。他们从两个患者体内提取并克隆了正常的结肠组织，与肿瘤类器官进行实验对比。实验表明，所有在共培养过程中，被诱导的T细胞应答仅限于肿瘤类器官。 图四 有无IFNγ对T细胞应答的影响 4.CD4+T细胞对异基因组织培养的反应 除了CD8+T细胞有肿瘤反应性，作者们还发现在实验过程中发现了一些CD4+T细胞反应。值得注意的是，CD4+T细胞的反应并不仅限于肿瘤类器官与外周血细胞的共培育中，在某些情况下，这种反应还会出现在对照组（患者的正常组织）类器官上。由于这种出现在对照组上的应答是存在于CD4+T细胞，与CD8+T细胞无关，作者们假设这种情况出现是因为外部环境中的抗原。通过实验，作者发现，类器官在小鼠基膜上培育是，会沾染到小鼠抗原，这种抗原会表现在T细胞反应上。因此，在正常组织类器官上发现的CD4+T细胞应答并不是针对肿瘤抗原的。 5.肿瘤类器官被自体肿瘤应答T细胞杀死 根据之前的内容，我们可以确定，通过共培养获得自体肿瘤应答CD8+T细胞是一种可行的方法。接下，则需要确认这个方法是否能用于评估T细胞杀伤肿瘤的效率。研究员把肿瘤类器官和自体肿瘤应答T细胞群共同培养了三天后，测量存活的肿瘤细胞数量，以判断T细胞的杀伤效率。所有被测试的样本都表明，肿瘤类器官暴露在自体T细胞中，它的生存率会明显降低。随后，研究员又在样本中添加了MHC I型阻断抗体，结果肿瘤类器官恢复生长。这表明了最初肿瘤细胞的消失是由于抗原特异性CD8+T细胞反应。因此，肿瘤类器官能够用来衡量自体T细胞破坏肿瘤的速度。 文章总结 在精准治疗领域，实现个性化医疗的患者特异性模型系统潜力巨大。由于人体内的白细胞抗原和T细胞受体基因存在遗传多样性，每个癌症患者的肿瘤抗原表达存在着差异，T细胞介导的肿瘤杀伤被各方面的因素影响，肿瘤免疫治疗对不同患者的效果也不相同。目前人类对T细胞识别的研究大多集中在黑色素瘤的治疗上，没有出现一个能够衡量其他肿瘤与T细胞之间的相互作用的患者特异性系统。而这篇文章建立的个性化模型系统提供了未来进一步研究的方向。目前来说，这个平台主要能应用在两个方面。一，它提供了一个流程化判断不同患者的肿瘤细胞敏感性和抗免疫疗法的流程。二，它提供了一种无偏获取肿瘤特异性T细胞的方案。 小编评论 本文作者证实了外周血淋巴细胞和肿瘤类器官共培育获得的肿瘤应答T细胞具有肿瘤特异性和杀伤性，进一步推动了肿瘤免疫治疗的发展。未来，或许只要一次微创手术（如针刺活检）和血样抽取，获取少量肿瘤细胞和患者外周血，就能培育出相应的肿瘤应答T细胞，不论患者处于癌症治疗的哪个时间点，都能得到精确的个性化免疫治疗。 参考文献： [1] Dijkstra K K, Cattaneo C M, Weeber F, et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids[J]. Cell, 2018, 174(6): 1586-1598. e12. |
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