文章系列——Cell. | 外周血淋巴细胞和肿瘤类器官共培养生成肿瘤反应性T细胞

Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids

（Cell. 2018 Sep 6;174(6):1586-1598.e12.）

Abstract

癌症免疫疗法对一部分上皮性癌症患者显示出了大量的临床活性。尽管如此，目前还缺乏研究个体患者的癌症T细胞相互作用和了解反应性决定因素的技术平台。在这里，作者建立并验证了一个以个性化的方式诱导和分析肿瘤特异性T细胞对上皮性癌症的反应的平台。证明自体肿瘤类器官和外周血淋巴细胞的共培养可用来富集错配修复缺陷结直肠癌和非小细胞肺癌患者外周血中的肿瘤反应性T细胞。此外，还证明用这些T细胞来评估杀死匹配的肿瘤类器官的效率。该平台为分离肿瘤反应性T细胞提供了一种无偏倚的策略，及一种在个体患者水平上评估肿瘤细胞对T细胞攻击的敏感性的方法。

Introduction

使用针对免疫检查点的抗体，如CTLA-4和PD-1/PD-L1，对晚期癌症患者具有明显的临床益处，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC)和错配修复缺陷()结直肠癌(dMMR CRC)。此外，体外扩增的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的过继转移在黑色素瘤中表现出令人印象深刻的临床反应。尽管有这些结果令人鼓舞，但很大一部分患者对目前的免疫疗法没有反应。治疗失败包含多种原因，如少量免疫原性抗原、缺陷抗原呈递和/或替代免疫检查点分子的表达。鉴于癌症免疫逃避机制的多样性，目前预测个体患者是否对免疫治疗敏感、耐药性的机制以及哪种替代治疗可能克服耐药性具有挑战性。

如果存在一个平台能够根据不同患者的情况，准确并系统性地分析患者体内T细胞介导的肿瘤识别，科学家们就能更好地了解实现抗肿瘤免疫反应的关键因素。传统上，体外系统分析T细胞肿瘤相互作用在很大程度上集中在皮肤黑色素瘤，因为一方面，这是因为利用体外系统扩大的肿瘤浸润T细胞已经被证实能有效地治疗皮肤黑色素瘤；另一方面，也是因为黑色素瘤细胞系的获取相对来说比较容易。然而，随着免疫治疗对主要上皮性癌症的广泛临床发展和临床应用，开发新技术来深入了解肿瘤中T细胞介导的肿瘤识别是至关重要的。

Results

1)培养错配修复缺陷直肠癌（dMMRCRC类器官）和其特性分析

考虑到dMMRCRC高突变负荷和对抗pd-1治疗的频繁反应。为了评估肿瘤反应性T细胞是否可以通过自体肿瘤类器官的刺激而被PBLs富集，作者收集CRC患者的血液并获得肿瘤组织。从切除标本或芯针活检中获得新鲜的肿瘤组织用于建立类器官。根据之前的数据，用这种方式建立肿瘤类器官的成功率为60%。

作者建立了来自13例不同的dMM RCRC患者的15个肿瘤类器官组（表1）。类器官从形态学上与原始肿瘤非常相似(图1A和S1)。肿瘤类器官的全外显子组测序(WES)显示出较高的突变负担（突变范围795-2877），与之前报道的高突变CRC相符合(图1B)。与高突变的结直肠癌相关的典型突变也在这些类器官中出现(图1C)。考虑到主要组织相容性复合体I类(MHCI类)的丧失在高达60%的dMMRCRC中发生，作者在干扰素(INF-γ)刺激后筛选MHCI类表达，并从8名患者（62%的类器官样本）中鉴定出9个MHC-I熟练的肿瘤类器官(图1D)。肿瘤类器官的MHCI类表达与来自肿瘤的MHCI类表达的免疫组化数据相关(Spearmanr=0.78；p=0.01)。最重要的是，被归类为MHCI类缺陷的肿瘤类器官总是来源于MHCI类缺陷的肿瘤，这表明MHCI类的缺失并不是类器官培养的一般特征。

图1. dMMRCRC类器官的特性分析

2)与自体肿瘤类器官共培养，诱导循环T细胞的肿瘤反应性

为了检测肿瘤类器官是否可用于肿瘤反应性T细胞的获得，作者用来自同一患者的外周血细胞和肿瘤类器官共培育肿瘤应答T细胞。在与自体T细胞共培养之前，用INF-γ预先刺激肿瘤类器官以增强抗原呈递。INF-γ暴露也导致了T细胞激活的负调控因子PD-L1的诱导(图1E)，为了抵消T细胞激活过程中PD-L1的抑制作用，作者添加了PD-1阻断抗体。加入抗CD28和IL-2，分别提供共刺激和支持T细胞增殖。每周用自体肿瘤类器官进行刺激外周血单个核细胞(PBMCs(图2A)。共培养2周后，通过对INF-γ和脱颗粒标志物CD107a进行染色来评估CD8 T细胞对肿瘤的识别能力。

8例类器官中有50%自体肿瘤类器官在共培养2周后，自体肿瘤类器官刺激诱导CD8 T细胞中INF-γ分泌和CD107a上调(图2B和2C)。反应的大小在患者之间有所不同，包括1%-3%肿瘤反应性CD8 T细胞的小但可重复的反应，以及所有CD8 T细胞的50%都为肿瘤反应性的患者。CRC-9的高反应性表明存在一个预先存在的肿瘤反应性T细胞群。因此，作者评估了T细胞在与肿瘤类器官共培养前（即直接从血液中分离）的肿瘤反应性。来自CRC-9患者的大量CD8 T细胞已经发生了肿瘤反应，在共培养2周后，这一群体的频率增加了约10倍(图2D和2E)。相比之下，来自CRC-11、CRC-12和CRC-13患者的T细胞在类器官共培养前没有显示出任何可检测到的肿瘤反应性(图2E)，表明T细胞类器官共培养系统也可以用于扩大原本没发现肿瘤反应的T细胞群。

图2. 与自体肿瘤类器官共培养诱导循环T细胞的肿瘤反应性

3)NSCLC患者循环T细胞中肿瘤反应性的诱导

然后，作者在非小细胞肺癌中评估了通过类器官共培养从外周血中获得肿瘤反应性T细胞群的策略的可行性。与dMMRCRC相比，NSCLC的突变负担大约降低了5倍，对PD-1/PD-L1阻断的反应仅限于约20%的患者。使用类似CRC类器官的方法作者从6例患者中生成了NSCLC类器官(图3A)。所有NSCLC类器官均为MHCI类熟练，并在INF-γ刺激下表达不同水平的PD-L1(图3B和3C)。在体外，将PBMCs暴露于自体肿瘤类器官中，在共培养2周后其中2例患者肿瘤反应性CD8 群体的扩大(图3D和3E)。值得注意的是，在与类器官共培养之前，这些反应都不能被一致地检测到(图3F)。综上所述，这些数据证明利用在两种上皮性肿瘤中共培养PBMCs和自体肿瘤类器官来诱导患者特异性肿瘤反应性T细胞反应是可行的。

图3 NSCLC患者循环T细胞中肿瘤反应性的诱导

4)类器官反应性T细胞反应的特异性

接下来，作者希望评估由类器官共培养诱导的T细胞反应是否真正具有肿瘤特异性，或者应该被认为是类器官培养或INF-γ治疗的人工产物。为评估肿瘤类器官诱导T细胞反应性对INF-γ的依赖性，作者将激活标记物CD137的T细胞表达与INF-γ预刺激或未处理的肿瘤类器官进行了比较(图4A)。发现：无论INF-γ预刺激如何，对肿瘤类器官的CD8 T细胞反应都相似。为评估T细胞对用于T细胞诱导的肿瘤类器官的反应性的限制，作者从两名患者(CRC-12和NSCLC-3)中建立了正常的结肠或肺类器官。此外，作者从CRC-13患者中生成了一个同步错配修复熟练(pMMR)CRC的类器官和一个dMMR CRC。在所有病例中，T细胞的反应性仅限于与PBLs共培养2周后诱导产生反应性的肿瘤类器官；也就是说，对正常组织或pMMRCRC类器官没有观察到反应性(图4B-4G)。

对于两例患者，自体肿瘤组织的单细胞消化也可用于刺激类器官反应性T细胞(图4F和4G)。对NSCLC-3类器官有反应的T细胞也对肿瘤消化有反应，但对正常的肺消化没有反应。相反，对NSCLC-1类器官有反应的T细胞则不产生用自体肿瘤消化液刺激后的INF-γ。以上实验表明：在共培养过程中，被诱导的T细胞应答仅限于肿瘤类器官，这也强调了从非恶性组织中生成类器官的作为对照组的价值。

图4 类器官反应性T细胞反应的特异性

5）CD4 T细胞对异种组织培养成分的反应性

除了肿瘤反应性CD8 T细胞反应外，作者还观察到在肿瘤类器官刺激下发生的CD4 T细胞反应(图5A)。值得注意的是，CD4 T细胞的反应性并不局限于肿瘤类器官，某些情况下，也出现在对照类器官(正常组织的类器官)（图5B）。由于只观察到CD4 T细胞控制类器官的交叉反应，而CD8 T细胞没有交叉反应，作者推测这可能是针对来自细胞外环境的外来抗原。为了解决这一假设，作者从患者CRC-1的PBMCs中生成单核细胞来源的树突状细胞(moDCs)，并将这些细胞装载Geltrex或肿瘤细胞或健康结肠类器官细胞。CD4 T细胞的反应性只能通过装载geltrex的树突状细胞或在Geltrex中生长的类器官的刺激来诱导(图5C)。此外，当类器官在没有Geltrex的情况下生长3天时，反应性基本消失(图5C和S4)。这表明，涉及Geltrex的共培养系统诱导的CD4 T细胞应答不是针对肿瘤抗原的。

图5 CD4 T细胞对异种组织培养成分的反应性

6）肿瘤类器官被自体肿瘤反应性T细胞杀死

在确定了为相当一部分患者诱导自体肿瘤反应性CD8 T细胞产物的可行性后，接下来的目标是确定类器官系统是否可以用于评估这些T细胞破坏肿瘤的效率。作者将肿瘤类器官与自体肿瘤反应性T细胞群共培养3天，并通过流式细胞术定量活肿瘤细胞的数量。对于所有测试的样本，肿瘤类器官暴露于自体T细胞导致存活率显著降低(图6A)。添加MHCI类阻断抗体挽救了肿瘤细胞的存活，证明了抗原特异性CD8 T细胞反应的存在。为了观察肿瘤反应性T细胞的溶细胞活性，作者用示踪染料标记NSCLC-1类器官，并在绿色荧光凋亡探针检测活性caspase-3/7下进行成像(图6B)。添加自体T细胞导致类器官大小减小，并伴随着广泛的细胞凋亡。

为了进一步为自体T细胞杀伤肿瘤细胞的特异性提供证据，作者对肿瘤和健康的NSCLC-3类器官进行了平行的细胞毒性试验。T细胞首先使用之前建立的快速扩增方案来生成用于过继细胞治疗的TIL产品(Dudleyetal.，2003)。T细胞能有效地杀死肿瘤类器官，但不影响健康类器官的存活(图6C)。实时成像显示，当与自体T细胞孵育时，T细胞介导的对肿瘤类器官的强杀伤(图6d和S5)。没有T细胞或有MHCI类和MHCII类阻断抗体的T细胞培养的肿瘤类器官继续增殖。作为进一步的对照，无论T细胞是否存在，健康的类器官都会继续增殖(图6D)。综上所述，这些数据表明，上皮性肿瘤的类器官可以用来测量自体T细胞的破坏率。

图6 肿瘤类器官被自体肿瘤反应性T细胞杀死

Conclusion

本文作者建立的个性化模型系统为未来研究提供方向。目前该系统主要应用有两方面。一，它提供了一个流程化判断不同患者的肿瘤细胞敏感性和抗免疫疗法的流程。二，它提供了一种无偏获取肿瘤特异性T细胞的方案。证实了外周血淋巴细胞和肿瘤类器官共培育获得的肿瘤应答T细胞具有肿瘤特异性和杀伤性，进一步推动了肿瘤免疫治疗的发展。

DOI：10.1016/j.ccell.2022.02.003.