【文章解读】突变特征分类揭示食道腺癌治疗新模式

文章题目：Mutational signatures in esophageal adenocarcinoma define etiologically distinct subgroups with therapeutic relevance

研究团队： 剑桥大学，英国癌症研究和医学研究委员会

发表时间：2016.09

期刊名称：Nature Genetics

影响因子：27.959

研究背景

目前食道癌的治疗方法主要是以食管切除、化疗和放疗为主，分子靶向制剂的使用效果很差，只有针对ERBB-2阳性的转移瘤使用曲妥珠单抗有较好疗效。

二代测序为癌症的特征分类研究提供了诸多的新方法，如snp、结构重排、变异频谱等，为临床的分层试验和病人的预后良好起了很好的促进作用。外显子测序和少量的全基因组测序已经揭示了部分的食管腺癌（EAC）潜在驱动突变基因，但许多发生在肿瘤抑癌基因的突变，如TP53，SMAD4，ARID1A等仍未研究清楚。我们已检测出基因组不稳定、复杂的重组导致了患者之间的显著异质性，但是目前仍缺乏有效方法来利用这些复杂的分子数据，对病人进行分类以帮助临床决策的制定。本研究利用突变频谱来帮助临床决策的制定。

样本选择

样品：129份来源于食管胃结合部，Siewert 1型和2型的肿瘤组织。

测序：129份样品进行50x WGS测序，该数据属于the International Cancer Genome Consortium project的项目之一。

分析方法

1.大规模变异分析

利用129份EAC的WGS数据进行拷贝数，snp，indel，SNV以及somatic indel分析。具体方法如下：

1. 比对分析：bwa 0.5.9 的bwa men比对到GRCh37基因组，采用Picard 1.105进行冗余标记和去除，用FastqQC进行质控。

2. SNV/InDel分析：采用Strelka 1.0.13进行体细胞变异(SNV)和插入缺失（indel）分析；采用Variant Effect PredictorVEP release 75进行功能注释

3. 显著突变基因：MutSigCV软件(adjusted P <>

4. 拷贝数变异分析：

1. ASCAT-NGS v2.1进行细胞污染评估后，利用GATK3.2-2计算germline杂合位点的reads数并评估拷贝数。

2. 采用GISTIC2.0计算显著扩增/缺失区域

（参数设置：-ta 0.1;-td 0.1;score>=2; deletions<=−2；q-value><>

5. SV分析：用Manta识别putative breakpoint junctions的聚类，得到raw   SV,再进行过滤：

1. reads深度极高的区域

2. 小于1000bp的不支持缺失连接的区域

3. 10k的小颠倒区域（可能是建库过程中产生的）

4. 卫星序列，gap重叠区域，简单重复序列大于1000

通过以上得到的SV为最终结果。

6. 重排基因分析：

1. 去除已知的注释脆性位点

2. 计算未注释的脆性位点得分：S_gene=D_bxN_pxL_gene

   (D_b：断点密度，断点个数除以基因组长度；N_p：基因缺失个数；L_gene：基因长度)

   S_gene最高的前1%且S_gene  > 99%S_gene*10 通过以上条件的被确认为重排基因。

7. 突变特征分析（mutational signature）

   利用NMF，pmsignature，SomaticSignatures查找变异频谱：

1. 以NMF方法为主，用pmsignature，SomaticSignatures验证准确性，得到频谱信息。

2. 突变频谱聚类：以Pearson相关系数作为距离进行聚类，进而得到不同的分组。

结果

大规模的变异分析

结果如下图所示。

检测到显著重排基因包括SMYD3(39%)，RUNX1(27%)，CTNNA3(22%), RBFOX1(21%), CDKN2A/2B(18%),  CDK14 (16%)。

用GISTIC检测到的显著扩增区域：7q22、13q14、18q11，这些区域包含ERBB2、EGFR、RB1、GATA4/6、CCND1、MDM2 基因；缺失区域有9p21、21p11、3p14，这些区域有CLDN22、CDKN2A、CDKN2B基因的缺失。

显著突变基因分析：检测到TP53 (81%, P < 0.0001),="" arid1a="" (17%,="" p="">< 0.0001),="" smad4="" (16%,="" p="">< 0.0001),="" cdkn2a="" (15%,="" p="">< 0.0001),="" kcnq3="" (12%,="" p="">< 0.001),="" ccdc102b="" (9%,="" p="0.031)" ，="" cyp7b1="" (7%,="" p="">

图1    大规模变异分析结果

突变频谱分析

分析发现有6个主要的突变频谱：S17A(CTT,T>G)；EAC标记性的频谱；S17B(CTT,T>C)； S3(TCA/TCT, C>T)；S2, S1(*CG,C>T)；S18-like(GCA/TCT, C>A/T)。用pmsignature 分析发现S17的−3 和−2位置产生了A/T碱基的偏移域，在别的频谱中没有出现这种情况。这说明S17突变发生位置附近的碱基会产生偏移，因此S17的突变频谱中可能存在一个复杂的机制在作用。

对6个主要的频谱进行聚类，得到了3个簇（cluster）：

Cluster1：C>A/T-dominant，大规模的重复较少而染色体间的易位频率较高，意味着转移元件插入事件发生的比较多且该聚类和年龄有关系。

Cluster2：DDR-impaired（DNA damage repair impaired），DNA的修复机制削弱，有450个基因的突变与DDR相关。其中同源重组途径（HR pathway ：homologous recombination pathway）的变异产生基因富集现象。

Cluster3：mutagenic，该亚型有着较高数量的非同义突变，而且肿瘤中含有较多CD8+ T的免疫细胞。

图2    对主要频谱的聚类分析结果

总结

对129名EAC患者的WGS数据进行变异分析，发现突变频谱分析能将EAC分为3类。

Cluster1：C>A/T-dominant，大规模的重复较少，而染色体间的易位频率较高。存在ERBB2/MET的变异富集，可通过ERBB2/MET抑制剂治疗。

Cluster2：DDR-impaired（DNA damage repair impaired），DDR损伤被认为会增加个体患乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的风险。有研究表明变异富集在同源重组途径上，利用PARP抑制剂一类的家族药物有效修复同源重组途径的功能障碍，不仅给这类癌症亚型患者带来一定益处，而且PARP抑制剂通过癌细胞修复DNA的弱点来靶向杀灭癌细胞。

Cluster3：mutagenic，该亚型与免疫细胞有关，这类免疫疗法药物能够治疗许多类型的癌症，比如皮肤癌等。

下图展示了针对以上3个EAC分类进行临床治疗决策的方向。

图3    对3个EAC分类进行临床治疗决策的方向

参考文献：

[1] Maria Secrier,Xiaodun Li,Nadeera de Silva,et al.Mutational signatures in esophageal adenocarcinoma define etiologically distinct subgroups with therapeutic relevance[J].Nature Genetics, 2016, 48: 1131-3341.