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文章题目：Evolution of Neoantigen Landscape during Immune Checkpoint Blockade in Non–Small Cell Lung Cancer 研究团队：The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine 发表时间：2016. 12 期刊名称：Cancer Discovery 影响因子：20.011研究背景 肿瘤细胞中含有体细胞非同义突变，这些突变对免疫系统而言是外来的，因此可能成为肿瘤特异性新抗原，在机体免疫过程中诱导抗肿瘤的免疫反应。近来研究发现，在非小细胞肺癌和黑色素瘤中，体细胞突变和新抗原密度与长期受益于免疫检查点阻断治疗密切相关，这表明了通过阻断突变相关的新抗原（MANA）的内源性应答的免疫检查点的方式，高密度的体细胞突变新抗原可以在免疫治疗过程中增强临床效益。PD-L1在肿瘤或肿瘤浸润性免疫细胞中的表达与PD-1阻断的反应有关; 然而，PD-L1表达或其他免疫生物标志物还不足以完全解释治疗结果。 在最初对PD-1阻断产生响应的患者中，一些患者对治疗产生了抗药性。在这些产生抗药性的患者中，一部分患者的免疫逃逸机制不再是过去所认为的由免疫检查点的上调所引起的，可能是由于HLA单倍型的丧失或HLA或JAK1 / JAK2基因的体细胞突变等因素造成的然而，对于免疫检查点阻断的响应和获得性抵抗的根本机制目前还不是很清楚。为了研究免疫治疗抵抗的机制，研究人员对蛋白编码基因进行全基因组测序分析和T细胞受体（TCR）克隆型分析，然后对免疫检查点阻断具有初步响应但最终发展为进行性疾病的病人，进行自体T细胞活化的功能试验。这些分析表明通过肿瘤细胞消除或者染色体缺失的方式，一些具有免疫原性的MANA在抵抗性肿瘤中发生了缺失现象，表明了机体对免疫检查点阻断获得性抵抗的新机制。 图1：二代测序、新抗原预测和功能性T细胞分析的概述 研究方法 研究对象： 4例接受免疫检查点阻断治疗的非小细胞肺癌患者 研究方法： 全外显子测序、新抗原预测、TCR测序、免疫组化分析 研究成果 在42例单剂PD-1或组合PD-1和CTLA-4阻断治疗的NSCLC患者队列中，研究者选取了4个发生获得性抵抗的患者，从相同解剖位置（CGLU117）或者解剖学邻近位置（CGLU116，CGLU127和CGLU161）获得预处理和抵抗后样本用于后续的分析研究。通过对肿瘤组织进行全外显子测序来分析基因组改变和相关的新抗原。 研究过程中，使用高灵敏度突变检测流程在四个免疫治疗前肿瘤样本中分别检测到129、302、344和127个体细胞突变。突变的种类以及数目，包括特定的驱动基因与非小细胞肺癌之前报道过的结果一致。在抵抗后的四个肿瘤样本中发现了177、323、354和142个体细胞突变，总突变数目相较预处理样本有所变化。 研究人员使用多维新生抗原预测平台检测了从体细胞变异中产生的免疫相关的肽段。这种方法可以识别在突变基因中由MHC I类蛋白加工和呈递的肽段，这些肽段可能会引发免疫反应。该算法评估了突变肽段（8-11mers）与患者特异性MHC I类等位基因的结合情况，并根据MHC结合亲和力、抗原加工和自相似性对新抗原进行排序。由于肿瘤组织有限，不能同时进行基因组学分析和表达分析，因此研究人员只对TCGA中肺癌样本进行突变基因平均表达量的评估。在预处理的肿瘤样本中分别确定了106、240、316和102例候选突变相关的新抗原（cMANA），在对免疫检查点阻断抵抗的肿瘤样本中分别鉴定了144、250、326和119个cMANA。 由于耐药性肿瘤中的高突变负荷并不意味着对免疫检查点阻断响应相关的突变数量较多，因此作者分析了获得的基因突变是否主要富集在与新抗原不相关的突变中。结果发现在免疫治疗后，未编码新抗原的突变在获得的突变中的比例高于在消除的突变中的比例，表明免疫治疗后获得的突变可能与抗肿瘤免疫反应没有太大的关系。然后对已知的潜在的抵抗机制相关因素进行分析，发现在治疗后的样品中，编码PD-L1的CD274基因，编码PD-1的PDCD1基因以及CTLA-4、JAK1、JAK2等基因均没有新的基因突变或者拷贝数变化。此外，HLA基因，β2微球蛋白或其他抗原呈递相关基因也没有发生新的基因突变。 图2：在预处理和抵抗后的肿瘤样本中对消除的突变进行突变细胞性分析 研究发现在4个病人中，分别有18、10、7和6个cMANA在预处理肿瘤组织中是存在的，但是在抵抗后的肿瘤样本中被消除。除了在CGLU116病人中存在一个PCSK4基因的移码突变外，其他被消除的cMANAs都是单碱基取代的突变形式。在预测的MHC结合亲和力<50nmol> 在评估免疫应答的过程中，功能性T细胞的识别是至关重要的。为此，研究者开发了一种精准的方法用于评估T细胞对cMANA的反应，通过对TCR-Vβ CDR3区域进行测序来测量T细胞克隆性。通过这种方法在体外比较TCR-Vβ克隆性在cMANA肽段刺激前和刺激后的差别，除了比常规的酶联免疫斑点测定更敏感，还能将cMANA扩增的TCR-Vβ CDR3与患者肿瘤中发现的进行匹配。因此，该方法用于评估已知存在于肿瘤微环境内的T细胞的MANA特异性应答。 图3：在刺激的T细胞培养基中特异性新抗原的TCR扩增 为了评估消除的新抗原的T细胞识别，在10天培养系统中用装载有cMANA肽的自体外周血单核细胞（PBMC）刺激来自患者CGLU116，CGLU127和CGLU161的纯化的外周血T细胞。然后利用TCR二代测序技术来评估这些扩增的T细胞群体中新抗原特异性T细胞克隆型的丰度差异。为了进一步研究消除cMANAs的重要性，我们生成了保留和获得cMANAs的肽，并评估了其引发MANA特异性T细胞扩增的潜力。 在患者CGLU116中，测试的所有消除的cMANA肽可以诱导克隆T细胞扩增。含有突变（PGPA1 903Y> F和SLC26A7 117R> Q）的肽可以引起新抗原-特异性克隆T细胞扩增，在野生型肽中没有观察到相应的反应。在编码HELB 987P> S突变的多种肽以及一种野生型肽中，观察到了T细胞反应，其中突变型肽能够导致更强的免疫应答。在患者CGLU127中发现ANKRD12 603K> T的突变体和野生型肽都具有特异性的T细胞反应。在患者CGLU161中观察到了EP3001250C > Y突变体肽的特异性T细胞反应。研究发现CGLU127和CGLU161的7种保留的cMANA肽都不具有免疫原性，而在CGLU116中，一部分保留的cMANA肽可以引起MANA特异性克隆T细胞扩增。通过对CGLU116患者获得的cMANAs进行评估发现在患者的自体T细胞培养物中，一小部分获得的cMANA肽（30％的测试肽）能够引起MANA特异性克隆T细胞扩增。这些发现说明了来源于病人的T细胞可以识别这些消除的新抗原，进而表明了新抗原是免疫检查点阻断的最初治疗反应的相关靶标。 图4：对免疫检查点阻断的抵抗与通过LOH和更多不依赖于PD-L1表达的反向T细胞库消除的突变相关新抗原有关 在概念上，抵抗性肿瘤中可能存在两种新抗原缺失的机制。第一个是通过免疫消除含有新抗原的肿瘤细胞群体，剩余的肿瘤细胞继续生长。第二个是通过在肿瘤细胞中发生一个或多个基因组事件导致肿瘤新抗原的缺失，随后选择和扩增抗性克隆。为了评估这些机制在新抗原缺失中发挥的作用，研究者使用SCHISM流程分析了治疗前后的肿瘤，并且引入突变频率，肿瘤纯度和拷贝数变异等概念来推断含有特定突变的细胞的比例。通过分析可以认为突变细胞数> 0.75的突变是存在于所有肿瘤细胞中的，而其余的被认为是亚克隆的。研究发现了：在出现抗性时，有3个主克隆突变丢失，38个亚克隆cMANA丢失。全基因组结构改变的分析显示，所有克隆新抗原的丢失主要是通过染色体缺失和LOH的基因组改变所造成的。结果表明亚克隆新抗原的丢失主要通过LOH或肿瘤亚克隆丢失的方式引起的。 为了评估新抗原的变化对细胞毒性TCR受体库的影响，研究人员分析了在免疫治疗过程中连续收集的PBMCs，结果推断新抗原的丢失将导致细胞毒性TCR克隆性的降低，因此导致了抵抗时出现的肿瘤免疫逃逸现象。在CGLU127和CGLU117患者中观察到一些最常见瘤内克隆的外周T细胞扩增，结果发现最常见的克隆在响应时血液丰度增加了44倍和25倍，在抵抗时降低到预处理水平。以上观察结果表明，TCR扩增可能是对检查点阻断响应的有用方法，也是通过新抗原缺失而获得性抵抗的一个指标。 结论 免疫检查点抑制剂对包含突变相关新抗原的肿瘤有显著的治疗响应。在用抗PD-1或抗-PD-1 /抗CTLA-4抗体进行免疫检测点阻断治疗的初始响应时期，研究者分析了非小细胞肺癌患者获得性抵抗出现期间肿瘤新抗原的变化情况。对匹配的预处理和抵抗性肿瘤组织的基因组变化情况进行分析，发现了7-18个推断与突变相关的新抗原在抵抗性肿瘤组织中发生了缺失事件。在自体T细胞培养物中，对消除的新抗原产生的肽段进行克隆T细胞扩增分析，结果表明它们能够产生功能性免疫应答，新抗原的缺失是由肿瘤亚克隆的消除或染色体特定区域的缺失所导致的。该研究分析了在免疫检查点阻断期间突变景观的动态变化，加深了对肿瘤新抗原免疫治疗相关的研究。 参考文献： [1] Valsamo Anagnostou, Kellie N. Smith, Patrick M. Forde, et, al. Evolution of Neoantigen Landscape during Immune Checkpoint Blockade in Non–Small Cell Lung Cancer[J].C |
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