肺癌专题 | 肺上皮细胞中的烟草特异性致癌钙离子通道通过IGF2胞吐促进肺癌发生

• nAChRs（Nicotinic acetylcholine receptors， 烟碱型乙酰胆碱受体）与NNK（Nicotine-derived nitrosamine ketone，尼古丁衍生的亚硝胺酮， 4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮）结合诱导Ca2+信号传导，这个机制与多种人类癌症相关。

• 发现：

• 研究了NNK介导的Ca2+信号在肺癌形成中的作用。

• 胰岛素样生长因子（IGFs）的显著过表达与吸烟者肿瘤前肺部病变中IGF-1R激活相关。

• NNK破坏了IGF2胞吐作用的调控途径，促进了肺肿瘤发生。

文章题目：The tobacco-specific carcinogen-operated calcium channel promotes lung tumorigenesis via IGF2 exocytosis in lung epithelial cells

研究人员：来自首尔大学药学院的研究人员

发表时间：2016. 05

期刊名称：Nature Communications

影响因子：12.124

研究背景

肺癌是主要的癌症相关死亡原因。许多旨在开发有效的肺癌疗法的研究仍没有突出的成效，因此，迫切需要制定抑制肺癌发生的新策略。肺癌发生为多步骤过程，通常是由于多年吸烟引起特定的原癌基因、肿瘤抑制基因以及表观遗传发生了改变，从而引起肺癌。

以前的研究已经证明，NNK不仅通过基因中心机制促进肺癌的发生，而且通过激活各种信号通路保护携带受损DNA的细胞免于凋亡。

研究成果

1.  IGF在肺癌发生过程中的过表达

• 来自吸烟者的非小细胞肺癌（NSCLC）组织与非吸烟者相比显示出更高的pIGF-1R水平（图1）。

• 仅在吸烟患者的组织中，pIGF-1R水平与IGF1和IGF2的水平显著相关（图2）。这些研究结果表明，吸烟加速IGFs作为肺上皮细胞IGF-1R激活自分泌配体的活性。

图1  在NSCLC患者的肿瘤前和肿瘤病变中调节IGF-信号传导的生物标志物

2   NNK激活肺上皮细胞中的IGF-1R通路

• 为研究IGF-1R激活对诱发肺癌产生的影响，研究人员使用具有高致癌潜力的NNK对人肺上皮细胞进行测试。

• NNK通过诱导对来自大气道原代培养的正常人肺上皮细胞，产生时间依赖性IGF-1R磷酸化

• NNK处理诱导IGF-1R信号级联的传播

• 与正常肺上皮细胞相比，携带p53表达缺失（HBEL / p53i）细胞显示出显著快速的IGF-1R和Akt磷酸化

• Western印迹和免疫沉淀）分析显示NNK以时间和剂量依赖的方式增加R细胞而不是在R-细胞中的IGF-1R磷酸化。

• 方法：通过利用R-（IGF-1R无效小鼠胚胎成纤维细胞）和R（用IGF-1R转染的细胞）来确认NNK诱导的IGF-1R活化

3   NNK诱导IGF2依赖性IGF-1R磷酸化

• 文章研究了基于NNK诱导的IGF-1R磷酸化的机制。

• 因为NNK处理诱导IGF-1R水平没有变化（图2），故而主要测量了负责NNK来源的IGF-1R磷酸化的生长因子的分泌情况。使用人类生长因子抗体，对NNK处理后的BEAS-2B细胞与对照组进行基于蛋白质组学的条件培养基筛选培养（CM）。蛋白质谱图显示出多种可溶性因子（图3a）。结果显示，与来自载体处理的CM对照细胞相比，NNK处理的CM细胞产生IGF2的量显著增加。

图2  通过烟草致癌物NNK在肺上皮细胞中激活IGF-1R信号级联

• 研究人员监测了NNK处理后的BEAS-2B细胞中IGF产生的动力学。

• 蛋白质印迹分析显示，30分钟内，在NNK处理后，细胞外IGF2的含量明显增加（图3b）。相比之下，NNK处理期间细胞内IGF2水平略有下降。在相同实验条件下IGF1含量保持不变。当用NNK处理时，BEAS-2B细胞（通过瞬时转染绿色荧光蛋白（GFP）共轭IGF2（命名为BEAS-2B/GFP-IGF2）实现IGF2过表达）显示GFP-IGF2的产生以及细胞溶质GFP-IGF2水平的降低与NNK诱导的IGF-1R磷酸化（图2e）一致。10nM和10μMNNK诱导，会产生相似水平的IGF2。共聚焦显微镜进一步证实NNK诱导的从囊泡状细胞质隔室到膜膜区域的IGF2的再分布（图3c）。

• 此外，研究人员还注意到，IGF-1R磷酸化的HBEL/p53i细胞与非永生化和永生化的正常肺上皮细胞相比，IGF2（而非IGF1，IGF1R和INSR）的底mRNA表达水平更高（图3d）。根据IGF2转录情况分析，NNK处理的HBEL/p53i细胞比HBEL细胞有更高水平的IGF-1R磷酸化。通过使用IGF2 siRNA转染或用针对IGF2的中和抗体（αIGF2）处理，发现NNK处理后的HBEL/p53i和BEAS-2B细胞中的IGF-1R磷酸化被减弱（图3e）。当添加到未处理的HBEL细胞时，NNK处理的HBEL/p53i细胞的条件培养基（CM）与NNK处理的HBEL细胞相比，显示出IGF-1R磷酸化程度更高（图3f，左）。此外，NNK处理的HBEL/p53i细胞的CM在αIGF2存在下诱导与未经NNK处理的HBEL细胞中IGF-1R磷酸化相比显著降低（图3f，右）。

• 酶联免疫吸附测定法分析表明，用NNK处理时，HBEL/p53i细胞与HBEL细胞相比有着更高的IGF2分泌水平（图3g）。相比之下，HBK/p53i和HBEL细胞在NNK处理下均未发现IGF1产生显著变化。由此证实了用shRNA对IGF2的转染抑制了NNK的诱导效应（图3h）和BEAS-2B细胞的锚定依赖性集落形成能力（图3i）。通过siRNA转染消耗BEAS-2B细胞中EGF或FGF水平对NNK诱导的IGF-1R磷酸化和细胞活力没有影响。这些发现表明，NNK诱导的IGF-1R磷酸化和肺上皮细胞的转化取决于IGF的分泌，特别是IGF2。

图3    NNK介导的IGF-1R磷酸化是IGF2依赖性的

4   Ca2+是NNK诱导的IGF2分泌的关键调节剂

• 研究人员研究了NNK诱导的IGF2分泌的机制。

• 透射电子显微镜显示有不与HBEL / p53i细胞质膜融合的圆形颗粒。在NNK处理后，HBEL / p53i细胞中发现几个附着于质膜的颗粒以及分泌囊未封闭到顶端质膜或连接到细胞外空间的现象。为了确定释放的囊泡是否含有IGF2，进行了免疫电子显微镜（immuno-EM）。如图4a所示，在NNK处理的HBEL / p53i细胞中清楚地观察到IGF2分泌。通过使用FM1-43染料的共聚焦显微镜进行NNK诱导的IGF2胞吐作用后IGF2分泌的定量实验。结果显示NNK处理对IGF2胞吐作用的增强。通过差异超速离心对NNK处理的细胞进行亚细胞分馏显示囊泡中IGF2蛋白水平的时间依赖性增加，并且胞吐抑制剂Exo1的预处理降低了囊泡中的IGF2水平（图4c）。Western印迹（图4d）和活细胞延时成像（图4e）进一步揭示了胞吐作用抑制剂Exo1对NNK诱导GFP-IGF2水平增加的抑制作用。

• 进一步确定IGF2分泌是否通过调节途径发生。

• 首先验证了各种囊泡运输相关蛋白的内生表达，包括t-和v-SNARE蛋白和Syts蛋白，特别是HBE中的Syt2和Syt7。还观察到两种小的鸟苷三磷酸酶（GTPases），Ras相关蛋白3A（Rab3A）和Rab27A的表达（在囊泡胞吐的晚期发挥主要作用）。

• 通过siRNA介导的基因敲除技术在NNK诱导的IGF2分泌中评估SYT2，SYT7，RAB3A和RAB27A缺失的影响。

• 与用对照siRNA转染的siRNA相比，在siSYT2和siSYT7转染的BEAS-2B / GFP-IGF2细胞中证实NNK诱导的GFP-IGF2分泌量显著降低（图4f）。 NNK处理的HBEL / p53i细胞的免疫荧光染色显示当用针对RAB3A或RAB27A的siRNA转染时，与细胞膜融合的IGF2显著降低（图4g）。 NNK诱导的GFP-IGF2分泌（图4h）和IGF-1R激活（图4i）也由于Rab表达的丧失而降低。这些研究结果表明，NNK刺激IGF2分泌的调控途径，导致肺上皮细胞中的IGF-1R活化。

图4   NNK通过调节胞吐作用诱导IGF2分泌

5    NNK通过L型VDCC触发Ca2+流入

• 研究β-AR和nAChR是否参与NNK介导的事件

• 已知NNK结合β-肾上腺素能受体（β-ARs）和nAChR，特别是α7nAChR亚型，所以接下来研究β-AR和nAChR是否参与NNK介导的事件。β-AR或nAChR的药物阻断部分抑制NNK介导的IGF2分泌。相比之下，阻断β-AR和nAChR诱导完全抑制NNK介导的IGF2分泌。因此，β-AR和nAChR都似乎有助于NNK诱导的对IGF2分泌的影响。然而，GEO中可用的数据集的分析显示，非吸烟者和吸烟者之间的ADRB1，ADRB2，CHRNA5和CHRFM7A（CHRNA7）的表达没有显著差异，表明除β-AR和nAChR基因表达的改变可能参与NNK介导的信号传导事件。

• 假设NNK刺激的Ca2+内流可能参与NNK诱导的IGF2分泌和IGF-1R磷酸化（根据已有发现）

• 有发现表明β-AR和nAChRs在钙信号中的作用。实际上，10nM和10μMNNK对增加细胞内Ca2+水平的效果相似。通过用AChR抑制剂美加胺（MCA）处理或通过用CHRNA7特异性siRNA转染，NNK对IGF-1R磷酸化的诱导，IGF2分泌和细胞内Ca2+水平的增加都被抑制。

• 此外，与不含Ca2+的培养基中NNK处理的细胞相比，在补充有Ca2+的培养基中暴露于NNK的HBE细胞具有显著的IGF-1R磷酸化（图5d）。相反，用细胞内（BAPTA-AM）和胞外（EGTA）Ca2+螯合剂处理抑制NNK诱导的pIGF-1R，发现细胞外IGF2水平的升高程度低于对照（图5e）。

• 细胞外的EGTA完全消除NNK诱导的IGF2释放和IGF-1R磷酸化（图5e）表明NNK诱导的Ca2+信号来自细胞外Ca2+的流入，而不是内部存储的释放。

• NNK诱导的Ca2+信号可能部分来自胞内

通过用2-APB（IP3受体拮抗剂）预处理，NNK诱导的IGF2分泌和IGF-1R磷酸化部分降低。因此，从内部释放Ca2+可能影响了部分肺上皮细胞中NNK诱导的IGF2分泌和IGF-1R磷酸化。即使在不存在NNK的情况下，添加BAPTA-AM也可以将IGF2和pIGF-1R降低到对照水平以下（图5e），也会降低pIGF-1R和细胞外IGF2水平。这些发现表明IGF2释放和IGF-1R活化可以由基础细胞内Ca2+水平诱导，表明Ca2+信号在由IGF2分泌介导的IGF-1R激活调节中的关键作用。

图4  NNK介导的细胞内Ca2+增加对于IGF2分泌和IGF-1R活化是重要的

6   VDCC在NNK诱导的IGF2分泌中的潜在影响

• 肺上皮细胞中VDCC成分的表达。VDCC由五个亚基组成：α1亚基形成VDCC的中心孔; α2亚基；δ亚; β亚基; γ亚基。实验检测到HBE细胞中几个VDCC亚基的转录物。

• BEAS-2B /GFP-IGF2细胞的延时成像分析表明，CACNA1D消耗完全抑制NNK诱导的IGF2分泌。用L型特异性钙通道阻断剂的治疗也会几乎完全抑制NNK诱导的IGF-1R磷酸化和IGF2分泌。

• 这些数据表明通过L型VDCC进入的Ca2+对于IGF2的胞吐作用至关重要。虽然nAChR的α7同种型是高度可渗透的Ca2+通道，但经过活化的nAChR的Ca2+进入可能不足以引发胞吐作用。我们通过使用高[K]来引发IGF2胞吐测试了这个研究。用高[K]孵育细胞导致IGF2分泌增加和IGF-1R磷酸化，然后通过用氨氯地平或硝苯地平预处理又完全抑制。

• 这些研究结果表明，NNK诱导的nAChR激活的关键作用是通过细胞膜去极化来激活VDCC，但是通过活化的nAChR的Ca2+进入可能不足以引发IGF2胞吐作用。此外，通过VDCC的细胞内[Ca2+]的增加可能刺激IGF2分泌的调节途径，导致肺上皮细胞中的IGF-1R活化。 其中，Ca2+介导的信号传导的主要参与者是钙结合蛋白钙调蛋白和Ca2+ /钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK）。

• 研究发现使用W-7（钙调素拮抗剂）或KN-93（CaMK抑制剂）治疗抑制NNK诱导的IGF-1R磷酸化和IGF2分泌。因此，与Src介导的在神经末端的胞吐作用的负调控相比，钙调蛋白-CaMK II-Src信号传导的激活似乎介导IGF2胞吐作用。

7   阻止Ca2+流入抑制肺肿瘤发生

• 抑制nAChR-VDCC介导的细胞溶质[Ca2+]增加对NNK诱导的肺肿瘤形成促进的作用

• 与载体处理的对照细胞相比，NNK处理的HBEL/p53i细胞获得转化的表型（显著增加的锚定依赖性集落形成，存活力和不依赖锚定的集落）。这些NNK诱导的转化表型通过用nAChR拮抗剂（美加胺），Ca2+螯合剂（BAPTA-AM）或CCB（硝苯地平和氨氯地平）的治疗来抑制。 CCB抑制NNK诱导的细胞内钙水平，IGF-1R磷酸化和IGF2分泌的能力甚至在治疗范围内的低浓度下也很好地保留。

• CCBs在FVB小鼠中NNK诱导的肿瘤形成中的抗肿瘤活性

• 肺部的总体评估表明，在NNK处理的小鼠中100％发生肺肿瘤，而对照小鼠的肺中没有肿瘤。相比之下，氨氯地平和硝苯地平治疗后小鼠肺肿瘤结节明显减少。与NNK处理的小鼠相比，肺的显微镜评估显示氨氯地平或硝苯地平治疗的小鼠的肿瘤产生多样性，肿瘤体积和肿瘤负荷的统计学显著降低。

• 观察到药物治疗后体重无明显变化且无任何可检测的器官毒性水平。药物的抗肿瘤活性与暴露于NNK中小鼠肺部的IGF-1R和Akt磷酸化的统计学相关性显著降低。总体而言，这些结果表明阻断钙通道能够抑制肺上皮细胞转化，来阻止吸烟者肺癌的发生。

• CCB摄入量和肺癌风险

• 进一步分析了2010年至2011年间收集的韩国健康保险评估与评估服务（HIRA-NPS）数据库，对CCB处方与肺癌诊断之间的横断面关联进行了定量评估。

• 最常规的CCB是氨氯地平，其次是硝苯地平，肺癌诊断流行率为0.60％。与男性相比，妇女不太可能与肺癌相关。与20-34岁相比，50岁以上的患者更可能与肺癌的诊断相关。具有二氢吡啶CCB处方的患者不太可能与肺癌诊断相关。这些发现表明CCB处方与肺癌诊断呈反比关系。

结论

文章确定了一种新的信号机制：烟草特异性致癌物NNK刺激nAChR-VDCC-IGF-1R途径的反式激活，提供具有存活潜力的恶变前肺细胞，从而诱导肺肿瘤形成。鉴于全世界15％的癌症都与烟草有关，IGF-1R途径的NNK活化可以帮助我们了解这些癌症。同时文章实验表明CCBs在个体的肺上皮细胞中IGF过量表达的潜在临床效用。目前大多数疗法在肺癌治疗者中疗效较差，肺癌治疗急需确定更好的靶点和预防疾病的新策略。因此，本研究对于吸烟者的癌症化学预防策略的发展具有重要的临床意义。最后文章提出了将Ca信号传导阻断药物（如CCBs）重新定位为一种完全新颖的IGF-1R靶向化学预防剂的新概念，并且该途径不存在引起代谢紊乱的潜在毒性。

参考文献：

[1] Hye-Jin Boo, Hye-Young Min, Hyun-Ji Jang, et, al.The tobacco-specific carcinogen-operated calcium channel promotes lung tumorigenesis via IGF2 exocytosis in lung epithelial cells[J].Nature Communications , 2016 :Published online.