文章解读 | HPV16中E7基因的保守性对其致癌作用至关重要

本研究在全世界范围内对感染了HPV病毒的数千位女性进行基因组分析，在病毒基因组中发现了一段对致癌作用至关重要的保守序列。

• 对5570例HPV16基因组进行分析，发现个体间差异较高

• 良性HPV16感染具有更多数量的非沉默变异(non-silent variants)

• E7基因在癌前病变组织和癌变组织中很明显的缺少遗传变异(保守性高)。

• HPV16罕见变异可能是由人APOBEC3的抗病毒活性所诱导的

文章题目：HPV16 E7 Genetic Conservation Is Critical to Carcinogenesis

研究人员：来自美国国立卫生研究院，美国国家癌症研究所（NCI）的研究团队

发表时间：2017. 09

期刊名称：Cell

影响因子：30.409

研究简介

图1  研究概览

高危型人乳头瘤状病毒(HR-HPV)持续感染是几乎是所有宫颈癌和癌前病变发生的原因。每年有超过50万的女性被确诊患有宫颈癌并且超过二十万人死于宫颈癌。大多数宫颈组织发生的HR-HPV感染都是良性的，并且这种感染是人体可以自动清除的。事实上，感染HR-HPV的女性中只有小部分(<5%)会发展成癌前病变（cervical intraepithelial="" neoplasia="" grade="" 3="" [cin3]="" or="" adenocarcinoma="" in="" situ="">

尽管所有类型的HR-HPV在基因方面都是相似的，但它们在患病率，适应性进化的衡量标准以及引发癌前病变和癌症的能力方面差别很大。根据定义，每种HR-HPV在L1保守区域与其他分型的差异至少为10％。HPV的遗传变异进化较慢; HR-HPV类型都属于Alpha属内的一个系统发育分支。尽管如此，HPV16具有独特的致癌性，由于HPV16感染所导致的宫颈癌病例占所有宫颈癌病例的一半。在由HPV诱导引发的其他癌症中，由HPV16所诱导的会占到更高的比例。在感染HPV病毒的女性中，接近一半女性体内的HPV病毒会持续2年左右，若再持续5年就会发展成癌前病变，这使得这种小型病毒成为最有力的致癌物质之一。HPV16具有独特的致癌性，但与其他高危型HPV致癌机制的不同之处尚不明确。实验过程中推测，可能是由于两个主要的HPV致癌基因E6和E7的某些突变导致了HPV16拥有独特的致癌性。

HPV16可以分为四个主要的变异谱系（A，B，C，D）和至少十个亚系(sublineages)（A1，A2，A3，A4，B1，C1，D1，D2，D3，D4）。最近，我们对大约一百万北加州女性进行筛查，从中选取了3215名感染HPV16且处于癌前病变阶段以及确诊患癌的女性并获取样本，对样本中HPV16进行高通量全基因组测序，这是迄今为止最大规模的病例-对照研究。我们发现A4,C,D2,D3是比较特殊的亚系，与最常见的A1/A2亚系相比，它们能够显著增加癌前病变和患癌的风险。

目前的问题是，更细微的变异是否会显示出风险差异，从而可以精准定位分子机制。我们使用全HPV基因组(whole-HPV-genome)测序方法进行HPV基因组的研究，以找出特殊的基因型-表型相关性，这些相关性可以通过大型流行病学研究来识别，以此作为进一步研究HPV致癌性的线索。接下来，我们将重点放在了HPV16亚型上，我们对上千例感染HPV16的样本进行了测序，样本覆盖了良性感染到肿瘤的各个阶段。据我们所知，此前从未有过大型的研究来评估HPV遗传变异和致癌性的具体问题。本研究中，我们对5570个HPV16样本进行了全基因组测序来评估HPV16内的遗传变异并确定HPV16单核苷酸多态性（SNPs）与宫颈癌前期/癌症风险之间的关联。

研究样本

PaP组群：来自加利福尼亚的3,215个感染HPV16的女性的样本

CVT：来自哥斯达黎加(CVT)58名女性配对多解剖位点的HPV16样本

SUCCEED：来自俄克拉荷马州(SUCCEED)的CIN 2或CIN2+的688个感染HPV16的宫颈细胞标本

IARC：来自国际癌症研究机构（IARC）的感染HPV16的浸润性宫颈癌的组织或细胞样本

研究成果

为了评估HPV16基因组变异，我们选择了来自加利福尼亚（PaP组群）的3,215个感染HPV16的女性和来自哥斯达黎加(CVT)58名女性配对多解剖位点(paired multiple anatomical site)的HPV16样本（来自宫颈刮片，外阴拭子，肛拭子和/或口腔清洗）。我们利用病例对照研究设计(case-control study design)来评估每个个体SNP对致癌性的影响以及HPV16谱系内罕见的变异分布。

然后，我们通过检测和研究来自俄克拉荷马州(SUCCEED)的CIN 2或CIN2+的688个感染HPV16的宫颈细胞标本和来自国际癌症研究机构（IARC）的感染HPV16的浸润性宫颈癌的组织或细胞样本，证实了主要遗传风险关联的普遍性。在四组样本的研究中，大多数女性患有HPV16 A1或A2变异亚系感染(variant sublineage infection)：PaP组群3,215名女性中的84.7％，CVT58名女性中的91.4％，SUCCEED688名女性中的85.8％，以及国际IARC研究中的1,609名女性中的53.7％都是这类感染。因此，我们最初着重分析发生在A1和A2亚系内的变异，然后，我们评估了在其他不太常见的谱系(A3–A4, B1, C1–C4, D1–D4)中是否存在显著的单核苷酸多态性和/或区域重复。

在女性个体间和女性身体不同部位间的HPV分离株多样性(Isolate Diversity)

在PaP组群的3,215名女性中，有2,445名女性(76％)HPV16基因组序列被鉴定为是独特的分离株(unique isolates)（differing by ≥2 nucleotides）。在这2445名女性中，只有24％的分离株基因组(isolate genomes)在两个或两个以上的女性之间是相同的。这种高水平分离株多样性在变异谱系中是一致的。为了重复和进一步探索这一发现，我们比较了CVT研究中来自女性和配对多位点的宫颈样本分离株。

在这58例女性的宫颈样本中，我们也发现了高水平的HPV16分离株多样性。这58例样本中，84.5％的HPV病毒分离株是独特的（n = 49）。

相反，对来自52名女性（其中两名女性有3个样本点）的54对配对多位点样本的评估显示，81.5％的个体内配对样本中的病毒分离株是相同的（共有的）（n = 44）。 在这些共有的分离株中，72.2％（n = 39）是完全相同的HPV16基因组序列。另外5对是由于一个核苷酸不同而被区分出来了。配对的宫颈-肛门，宫颈-外阴和宫颈-口腔样本均表明这种高水平的HPV16分离株在(同一)女性体内共享。

这证实了在女性个体间有高水平的HPV16分离株多样性，但在同一女性体内的多个位点不存在这样的高水平多样性；重要的是，配对的样本分析帮助证实了我们观察到的高水平的分离多样性不是由于测序错误造成的，因为在同一女性多个位点样本中没有看到类似的多样性。

SNP与癌前病变、癌症的关系

本研究共涉及1,985个SNPs，其中大多数都是罕见的SNPs，在HPV16 A1 / A2亚系中仅有103个最小等位基因频率（MAF）≥1.0%的SNPs。48个SNPs与CIN3+风险有关(p <0.05)，并且前10个p值最小的snps最小等位基因(the minor="" alleles)与降低cin3="" +的风险有关。位于urr区域的两个snp与降低cin3+风险密切相关，在多重检验调整后，确定这2个snps的位点是7387(or="" 0.04,p="1.6x10-9)和7359(OR" 0.06,p="">

在A2亚系中，有5个与CIN3 +相关的SNPs。在L2基因中，位点为5121的SNPs与增加CIN3+风险相关(OR 10.5,CI 1.3-82.0,p =0.02)。该SNPs是单倍型(单倍体基因型)的一部分，单倍型还包括位点为5032,4247和7507处的变异，它们代表了A2系统发生分支的子分支。仅考虑A1亚系中URR区域的SNPs，7387和7359是与降低CIN3 +风险相关性最高SNP（数据未显示）。在D亚系中，没有与CIN3 +显著相关的SNPs，原因可能是由于SNPs数量太少。

图2 与PaP组群A1/A2亚系中对照组相比，CIN3+与SNP的相关性

病毒基因区域的累积变异分析(Cumulative Variant Analysis)

我们根据每个病毒的基因区域或HPV16 A1 / A2亚系内的开放阅读框（ORF）的突变类型（即非同义，无义，同义）来评估遗传变异。使用负荷测试(burden test )来确定A1 / A2亚系病毒区域中病例组和对照组变异分布是否不同。尽管病例组和对照组的样本数量几乎相等，但从总体上来说，对照组与癌前病变/确诊癌症的病例组相比具有更多的遗传变异。特别是在对照组中有特别多的非同义和无义突变。从统计学角度来看，E7 ORF与对照组相比有较少的非同义和无义突变（OR 0.16，p = 1.1x10-7）。

HPV16基因组中的大量变异由罕见核苷酸变异(rare nucleotide variants)组成，并且对照组中罕见变异的数量更高。因此，我们也针对罕见变异进行了负荷分析。图3是病例组和对照组中观察到的累计的非同义和无义的罕见突变个数; 能够清晰的看到E7区域的病例组中的突变数较对照组中少很多（OR 0.16，p = 1.1x10-7）。

图3 PaP组群中CIN3+病例组和对照组中病毒基因组A1/A2亚系中罕见非沉默(non-silent)变异分布

统计显示，在E1（OR 0.64，p = 0.001）和L1（OR 0.55，p = 7.9x10-5）基因区域中也有很多的非同义和无义的罕见突变。 病例组和对照组中非同义/无义罕见变异的差异在L1 ORF区域均匀分布。然而在E7和E1区域，大量罕见变异常发生在基因3’末端（图4）。

图4 E7，E1,L1区域的罕见非同义突变

在对E7变异进行进一步评估时，发现大多数的变异都是在对照组的基因的中央区域或C羟基末端发生，但也有几个没有发生变异的区域。（图5）。

图5 HPV16病毒E7 ORF中非同义和无义核苷酸突变

进一步研究后，我们确定了大多数罕见的非同义/无义DNA突变都发生在E7 ORF（56.8％）内，特别是对照组中与APOBEC3相关的序列（p <0.01）。 因此，这些特定的dna突变可能是由于人类apobec3（ha3）胞苷脱氨酶的抗病毒活性而激活的。e7蛋白是两种主要的hpv癌基因蛋白之一（另一个是e6蛋白）;="" 然而，对照组和cin3+病例组中e6="">

图6 HPV16 E6 ORF中罕见非同义/无义核苷酸突变

在其他HPV16亚系（A3-A4，B1，C1-C4，D1-D4）中，可供分析的对照组数目较少，因为这些亚系在所研究群体中非常罕见，但也不排除这些亚系致癌能力更强（A4，C1，C4，D2 ，D3）。 尽管如此，但我们在所有的CIN3 +病例中都观察到了E7的低频变异（hypovariation）。

在SUCCEED组群的研究中，病例组中E7也存在低频变异，并且非同义/无义突变随着CIN2到CIN3 +病变严重程度增加而下降。CIN3 +病例组中E7的罕见非同义/无义突变的数量最少（n = 1,0.2％），通过对每个病毒基因区域之间进行两两比较，发现E7基因区域变异程度显著低于其他所有HPV16区域（各p <>

我们又对来自国际收集的1,609个子宫颈癌病例的HPV16基因组进行测序分析，以评估E7基因只存在少量遗传变异的普遍性。通过分析，我们确认了E7在这组病例样本中突变的低频性，因为只有0.8％的病例样本显示E7基因区域内存在罕见变异。此外，通过对病例样本内所有病毒基因区域中的遗传突变进行两两比较分析，确定E7基因区域变异程度显著低于其他基因区域（各p <0.001），也就是说更加保守。更重要的是，e7比e6更加保守（p =="">

非同义和同义序列分歧度(divergence)

dN/dS表示的是非同义替换和同义替换的比值，这个比值可以判断是否有选择压力作用于这个蛋白质编码的基因。如果dN/dS>1，则认为有正选择效应；如果dN/dS =1，则认为存在中性选择；如果dN/dS<><>

对于所有ORF而言，E7是最保守的ORF，E7总的dN/dS比值为0.054，是最小的。在A1 / A2亚系中，对照组E7的dN/dS比值大约是病例组的5.6倍(对照组：dN/dS比值为0.05; p = 1.3x10-4；病例组：dN/dS比率为0.28，p = 1.3x10-4)。这表明对照组中E7序列保守程度较低。相比之下，病例组中保守程度非常高，病例组中dN和dS均较低。相较于对照组，dN下降了6.5倍，dS下降了1.2倍。因此，E7中dN/dS比率较低的原因可能归因于对非同义变化的纯化选择（即，致癌性取决于高度保守的E7蛋白）。有趣的是，相比之下，E6在病例组和对照组中总dN/dS比值接近1.0，符合中性。E7 ORF具有最小的总dN/dS比率0.087（即高保守性），而E6具有最高比率1.12（即最小保守性）。

讨论

总的来说，本研究结果表明对HPV16的致癌性而言，其病毒基因组特定区域的低变异度是至关重要的。在后续的研究中，追踪本研究中关于E7的发现及其他相关的区域，以更深入地描述这些区域的遗传变异是很重要的。首先要做的是进行功能性研究，以了解特定的E7基因序列与HPV16致癌作用的关联，这也可能是潜在的治疗靶点。

参考文献：

[1]Lisa Mirabello，Meredith Yeager, et, al. [J].Cell, 2017,170(6): 1164-1174.