Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing
Tips：ATAC-seq整体实验操作过程并不复杂，但需注意一些细节和技巧。以下操作与原作protocol基本一致，但有所改进，有效提高建库成功率。 一、细胞收集与裂解按常规方法计数，在1.5ml离心管中收集大约50000细胞；以500×g的转速于4℃条件下离心5分钟。 大约50-100μl预冷PBS缓冲液洗涤一次；以500×g的转速，4℃条件下离心5分钟。 使用50-100μl预冷的裂解液轻轻吹打重悬细胞；冰上放置5-10分钟。 4℃条件下500×g离心5分钟，小心弃上清，立即进行下一步DNA转座反应实验。
Tips: 离心后注意观察细胞在管底的位置，吸取上清时减少细胞损失。细胞裂解期间可提前准备下一步转座反应所需试剂。
二、转座反应| 体积 | 试剂 |
|---|
| 25 μl | 2 x TD buffer (C) | | 5 μl | Tagment Enzyme (D) | | 0.5 μl | Lysis enhancer 2 (B2) | | 0.5 μl | Lysis enhancer 2 (B3) | | 19 μl | Nuclease free water | | 50 μl | Total |
样本置于冰上，按以上体系制备转座反应所需试剂： 以转座反应混合液重悬细胞，置于37℃ Thermomixer (Eppendorf) 以1000×rpm混匀30分钟。
Tips: 37℃反应也可置于恒温水浴锅中30-60分钟，每5-10手动轻轻混匀。
三、DNA 纯化添加Stop Buffer (E) 并混匀，室温放置3-5分钟。 使用Qiagen试剂盒纯化DNA，溶于21 μl Elution Buffer。
Tips: 纯化后DNA直接用于后续实验或长期保存于−20°C.
四、PCR扩增1、制备PCR反应体体系：
| 体积 | 试剂 |
|---|
| 20 μl | DNA | | 10 μl | 5 × Amplify Buffer | | 2.5 μl | Nextera PCR index 2 (i5) | | 2.5 μl | Nextera PCR index 2 (i7) | | 0.5 μl | PCR Enzyme | | 1.5 μl | dNTP Mix | | 13 μl | Nuclease free water | | 50 μl | Total |
2、PCR反应程序设定：
| Steps | Temperature | Time |
|---|
| 1 | 72℃ | 5 min | | 2 | 98℃ | 30 sec | | 3 | 98℃ | 15 sec | | 4 | 63℃ | 30 sec | | 5 | 72℃ | 3min | | 6 | Repeat steps 3-5 | 5-20 cycles | | 7 | 72℃ | 5 min | | 8 | 4 ℃ | ∞ |
Tips: 以上操作均在冰上进行，具体请参考试剂盒说明书。PCR总循环数需要自行调整，以最后回收500-1500ngDNA为宜。 五、文库DNA纯化使用1.1× 体积的纯化用磁珠（BACKMAN），去除adapter以及其它干扰成分。 纯化后DNA文库溶于适量（50-100 μl） Elution Buffer（Qiagen）。 使用Qiubit（Thermofisher）进行浓度定量（总量为1μg左右）。
Tips: 磁珠纯化具体操作请参照生产厂家说明书。
六、测序DNA文库经纯化后即可送测序，通常采用PE150测序策略，需10-15G左右数据量。
上海达澈生物科技有限公司
专注表观遗传学，提供全套ATAC-seq技术服务
技术优势基本分析个性化高级分析按客户需求提供个性化高级分析服务，产出高质量Figures，助力发表国际顶级期刊。 样本和周期常量细胞送样要求
常量实验要求细胞数≥50000个，要求新鲜的悬浮细胞或贴壁细胞，由我们提供全套建库所需试剂ATAC-seq Kit ，由客户当天即可完成实验和建库过程，所得到的DNA文库-20℃冻存，干冰运输。 微量细胞送样要求
微量实验要求细胞数≥80个。要求新鲜的悬浮细胞或贴壁细胞，由我们提供全套建库所需试剂ATAC-seq Kit ，由客户当天即可完成实验和建库过程，所得到的DNA文库-20℃冻存，干冰运输。 动物组织送样要求
要求组织量≥50mg，-80℃冻存，干冰运输。 植物组织送样要求
要求组织量≥5g，-80℃冻存，干冰运输。 周期
30个工作日
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