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正文 血液病的治疗，现在已经进入到一个精准治疗时代了，通过检测基因的变异状态对疾病进行鉴别诊断、预后分层、靶向治疗，已经成为一个共识，但是面对这么多的检测平台，我们应该如何选择呢？接下来，且听我细细道来。 一代测序  一代测序就是我们常说的Sanger测序。1977年，Frederick Sanger等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术，并且到目前为止，都是基因检测的金标准，人类基因组的测序正是基于一代测序技术完成的。
一代测序技术的优势是具有高度的准确性、简单、快捷、测序读长长（能达到800-1K bp），但是不足之处在于通量低、耗时长。所以，目前临床上的应用，主要是针对已知致病基因的突变位点进行扩增测序的。
所以说，如果要选用一代测序进行基因检测，首先要明确检测的具体位置，根据具体的位置进行引物设计，然后进行扩增、测序，最后将测序结果与标准序列比对，就可以得出该基因是否发生突变。 在血液病中，应用一代测序比较多的也是一些特定的基因，包括：FLT3、NPM1、CEBPA、KIT、IDH1、IDH2等，通过这些检测，可以对患者进行预后判断、靶向治疗指导，也可以在治疗过程中的进行疗效监测。
值得注意的是，一代测序的目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变，对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的病例筛查是难以完成的，还有一些大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，一代测序也无法实现。所以这类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的二代测序。
二代测序 二代测序又叫高通量测序，是继一代测序之后的革命性进步, 能够同时对成百上千个基因进行测序, 实现了大规模、高通量测序的目标。 二代测序技术的优势是测序通量和效率高，成本低廉，信息量丰富；但不足之处在于测序读长普遍较短（150-250bp），且用时较长。
随着技术的发展，人们已经逐渐认识到血液病的发生往往是多基因共同变异的结果，并且致病基因的研究带动了靶向药物的研究，越来越多的靶向药物已经运用在了病人的治疗上。这个时候，单靠一代测序，已经远远不能满足对疾病的治疗与探索，而二代测序的出现，正好解决了这一难题。 在二代测序中，我们经常听到一个词：Panel，我们可以把它理解为“套餐”，血液病是一类很复杂的疾病，它有很多不同的分类，而每一类疾病可能都有几个与疾病密切相关的基因突变，我们把这几个密切相关的基因打包做一个套餐，一次性全部检测出来，这就叫一个Panel。
比如说，白血病里最常发生的AML，与它密切相关的基因有20个，于是我们组套做成一个AML相关热点基因检测，对于疑似AML的患者，这一个检测下来，我们就可以对病人做出一些判断，包括危险度分层、是否可以服用靶向药物，如果对这个病人进行连续监测，我们还可以判断治疗效果如何，是否好转或恶化等等。
另外，有时我们需要对疾病进行研究，探索是否还存在一些未知的基因突变，这个时候小的Panel就不能满足了，我们可以选用几百个基因的大Panel，或者采用全基因组测序、全外显子测序等来满足疾病的科研探索。
除此以外，二代测序还可以进行转录组测序，用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选，以及表观遗传学方面的DNA甲基化相关研究等。
荧光定量PCR 
荧光定量PCR技术是在普通PCR技术上发展起来的一种新技术，借助荧光信号来检测PCR产物。
因为检测原理的限制，荧光定量PCR只能检测一些研究成熟的基因突变，所以临床上常用的，是对一些热点基因的定量跟踪。例如：MPN相关的JAK2、MPL、CALR基因突变等等。
但是，对于已知融合基因的检测，却让荧光定量PCR大放异彩。
在白血病中，融合基因的检测在鉴别诊断和疗效监测上的作用，已经达成了共识。尤其是BCR-ABL、PML-RARa等融合基因的检测，已经成为疾病诊断和疗效监测的重要标志。而荧光定量PCR这一技术的应用，让融合基因的检测变得快捷、准确，而且成本低廉。
一般上对于白血病患者，初诊的时候都要做一个大范围筛查，现在市面上常用的就是43种融合基因筛查，筛查得到的融合基因，可以帮助判断患者的疾病亚型，后续在治疗过程中，可以单独跟踪这一融合基因，现在指南共识中已经明确推荐BCR-ABL和PML-RARa可以用外周血作为标本来进行检测，省去了病人骨穿的痛苦，真正实现实时定量监测。
数字PCR
20 世纪末，Vogelstein等提出数字PCR的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的DNA模板，分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
数字PCR与荧光定量PCR同属PCR技术，所以也只能检测一些研究成熟的基因突变，但与荧光定量PCR 不同的是，数字PCR实现的是绝对定量，不依赖于CT值，不需要对照标准样品和标准曲线，因此不受扩增效率影响，检测结果更加准确。
数字PCR的另外一个优势是极高的灵敏度，所以可以检测到频率很低的基因突变，在血液病上的应用主要是MYD88、BRAF等研究的相对成熟的基因。
另外，正因为灵敏度高，所以数字PCR可以检测到外周血中的含量极少的ctDNA，这是其他技术平台所不能达到的，所以在实体肿瘤中的应用非常广泛，例如我们所熟知的肺癌的EGFR基因检测等等。
小结
血液病的分子诊断，离不开各种基因检测平台，可是平台多了，大家就分不清用哪个好了，其实没有哪个是最好的，也没有哪个是不好的，能够充分利用各个平台的优势，选择最合适的平台进行检测，才是我们的最终目标。 ——End—— |
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