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引言 客户完成高通量芯片检测以及数据分析后，一般需要挑选十来个基因进行PCR验证，而结果总让客户很头疼，因为PCR结果与芯片结果的吻合度存在差距。出现这种情况，并不意外，基因芯片是大规模筛选用的，反应样本整体的基因表达变化，但不能保证每一个基因的变化都与qPCR保持一致。同时基因芯片与qPCR本身就是两种不同的实验技术，两者存在差距是必然的。那如何提高两种技术结果之间的吻合度呢？ 一、多基因进行验证（扩大验证基因数）； 二、多样本进行验证（扩大验证样本量）； 三、设计与芯片检测贴近的引物（提高引物针对性）。 前两点很好理解，扩大基数，那结果吻合的概率也会大幅提升，今天小编主要给大家详细介绍第三点。 那如何设计与芯片检测贴近的引物呢？ 这就涉及如何查询芯片探针序列？关于这一点，可以在赛默飞官网上进行查询，具体操作流程请见下： 1. 进入赛默飞官网（https://www./cn/zh/home.html）网址，进入，主页如下:  2. 点击应用与技术——微阵列分析；  3. 点击进入下一界面，然后向下拉，点击“访问NetAffx分析中心”；  4. 进入到NetAffx分析中心，然后点击Register进行注册；    5. 然后按照个人情况填写注册信息，完成注册。  6. 然后登录，点击“NetAffy”下拉框，选择“NetAffy analysis center”，下面开始查询某一基因的探针序列。 01 针对miRNA芯片，比如miRNA4.0 以hsa-miR-16-5p为例，在客户miRNA4.0芯片的差异结果中，该miRNA的信息如下：探针集名称为MIMAT0000069_st。  在这种情况下选择“miRNA”；之后点击“NetAffy Query”；  出现以下操作页面，在框中填写您需要查询的miRNA名称（hsa-miR-16-5p）或探针名称（MIMAT0000069_st）， 然后选择芯片类型（miRNA 4.0），然后submit；  出现以下页面，得到相应的miRNA探针集信息；  点开后，获得如下页面，其中Sequence一栏即为探针序列。本身miRNA芯片的探针序列与数据库查询的miRNA系列是一致的。由于miRNA长度在22nt左右，探针的设计基本上覆盖所有区域，因此针对miRNA而言，并不需要这么麻烦的去查询探针序列，正常数据库查找序列即可用于PCR引物设计。 02 针对3’ IVT芯片，比如U133 Plus 2.0 、Primeview芯片 以ABCA6基因为例，在客户Primeview的差异结果中，该基因的信息如下，共有三条记录，这是由于Primeview芯片对同一基因有多条探针覆盖，可选择其中差异最大的一条记录。探针集名称为11739904_a_at。 在这种情况下选择“3’ IVT Expression”；之后点击“NetAffy Query”； 出现以下操作页面，在框中填写您需要查询的基因名称（ABCA6）或探针名称（11739904_a_at），这个时候注意如果填写基因名称往往会出现过多干扰信息，建议客户直接用探针名称进行搜索。然后选择芯片名字，例如是Primeview芯片，然后submit； 出现以下页面，得到相应的mRNA探针集信息； 点开相应信息，然后将界面下拉到Target Sequence部分， target Sequence是在该基因设计的所有探针的序列总长，Probe Info是Target Sequence序列的分解探针信息。若需要对这条基因进行qPCR验证，可以直接对上述Target Sequence序列两端或直接针对该序列设计引物即可。 03 针对WT芯片，比如Clariom D 、Clariom S、HTA系列芯片 以RAP1A基因为例，在客户Clariom D的差异结果中，该基因的信息如下：探针集名称为TC0100009418.hg.1。 在这种情况下选择Exon/Gene，再点击NetAffy Query， 出现以下操作页面，在框中填写您需要查询的基因名称（RAP1A）或探针名称（TC0100009418.hg.1），这个时候注意如果填写基因名称往往会出现过多干扰信息，建议客户直接用探针名称进行搜索。然后，选择芯片类型（Clariom D）；接着选择Transcript Clusters，之后submit； 出现以下页面，得到相应的探针集信息； 点开后，跳转至另一界面，界面下拉到Transcripts Detected By TC0100009418.hg.1部分，选择任一条RAP1A 记录， 然后点击进入下一个界面，拉至Exon Array Related Probe Sets部分，以下截图即为覆盖该基因的探针集信息。 其中参数： Evidence Level 1. core： 指来自RefSeq的最可靠证据和包含完整CDS信息的全长mRNA GenBank记录所支持的探针组。 2. extended: 指除了用于支持核心探针组之外的其他cDNA证据支持的探针组。扩展的证据来自其他Genbank mRNA，未注释为全长，EST序列，ENSEMBL基因集合，来自小鼠，大鼠或人的同线映射mRNA，mitoMap线粒体基因，microRNA登记基因，vegaGene和vegaPseudoGene记录。 3. Full: 指仅由计算基因预测证据支持的探针组。它们由基因和外显子预测算法支持，包括GeneID，GenScan，GenScanSubOptimal，exoniphy，RNAGene，sgpGene和Twinscan。 4. Free：引用由合并的注释支持的探针集，使得没有单个注释（或证据）包含探针集。不明确指的是无法明确分配给特定转录本群集的探测集。 Hybridization Target 1. unique：探针组中的所有探针仅与推定转录的阵列设计内容中的一个序列完全匹配。 绝大多数（> 80％）探针组是独特的。 2. identical： 探针组中的所有探针与推定转录的阵列设计内容中的多个序列完全匹配。 （这个类也被称为“相似”） 3. Mixed: 探针组中的探针与推定转录的阵列设计内容中的多于一个序列完全匹配或部分匹配。 这时候我们想挑选一条探针集的序列去做引物设计，可侧重挑选参数为core和unique，且大小在200以上的偏3'端的下游序列，便于引物设计。根据这些因素，可挑选探针集为2351919这条信息，点击进入下一界面，并下拉至Sequence部分，这部分序列即为该探针覆盖的靶序列，可直接针对这段序列进行引物设计。 >2351919 tttctcctttgcaatagcagttataacagatgtgaaaatatacttgactctaatatgattatacaaaagagcatggatgcatttcaaatgttagatattgctactataatcaaatgatttcatattgatctttttatcatgatcctccctatcaagcactaaaaagttgaaccattatactttatatctgtaatgatactgattatgaaatgtcccctcaaactcattgcagcagataac 北京中康博生物科技有限公司（beijing Cnkingbio Biotechnology Co.LTD）是北方乃至全国最大的Affymetrix检测中心之一，公司以数据分析为特色，整合Affymetrix基因芯片、Illumina二代测序、个性化生物信息分析三项核心服务。立足生命科学，为临床与基础研究领域的科学工作者提供分子生物学高端技术服务。 点击上方，关注“中康博生物” |
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