4步完成跨探针PCR引物设计？

表达谱芯片是科研工作者必不可少的科研工具之一，但很多芯片使用者反馈，利用RT-PCR方法验证表达谱芯片结果，偶尔相符率不高，这是为什么？

除了大家知道的原因——两种不同检测技术差别外，还有另一种影响因素，即表达谱芯片探针检测的mRNA区段位置与RT-PCR检测位置的差异引起的，这与mRNA的可变剪接有关，关于可变剪接部分小编就不详细讲啦，有不清楚的请各位自行寻求解决途径哈~ 我们此次主要讲述如何利用表达谱芯片内容和网络资源4步完成跨探针引物设计。

1.      探针序列获取

目前大家常用的、主流的表达谱芯片为Affymetrix和Agilent两家公司生产，两家公司对于芯片探针设计原理不同，Agilent公司的探针在mRNA的3’末端设计，一条长为60mer（60个碱基）的探针。Affymetrix公司的探针设计有几种，分别为1）在mRNA的3’末端设计，不过探针是多条探针组成的探针组（一般为11条），所有探针合并检测mRNA序列长度在100-几百bp，2）针对mRNA的每个外显子进行探针设计，3）每个外显子+每个可变剪接点进行探针设计。对于Affymetrix公司的表达谱芯片只有1）可以进行跨探针引物设计，其他两种很难做到。无论是Agilent公司表达谱芯片的探针序列还是Affymetrix公司表达谱芯片的探针组检测序列都可以请提供检测服务公司提供，也可以自己在对应公司官网上查询。

 

2.      目的基因序列获取

通过第一步查询到探针序列后，我们还需要查询到该探针检测的基因序列。利用芯片的注释查询到该探针检测的gene ID等信息，可以EntrezGeneID，也可以是GeneBank Accession。利用这些信息在NCBI数据库即可查询，具体操作为：打开NCBI数据库，选择nucleotide，在search栏中填写需要寻找的ID号，例如NM_015987，点击search开始搜索。

会获得如下界面，

点击FASTA，获取该基因序列，拷贝到word文档或.txt文件中即可，或直接进行后面分析。

3.      探针序列与基因序列比对

探针序列和基因序列进行比对分析，此分析可以用DNAMAN软件或NCBI网站进行，找出探针序列在基因序列的什么位置。我们以DNAMAN软件为例，查找Agielnt的human 8*60k上探针号为A_23_P117082（NM_015987，HEBP1）的序列，进行比对，发现探针覆盖了mRNA的1101-1160区段。

Ps：如何使用DNAMAN软件，大家可以利用度娘哦~也可以反馈到欧易生物，说不定下期就是DNAMAN软件的使用哦~

 

4.      引物的跨探针设计

在第三步序列比对的基础上，截取探针序列所在位置的前100 + 探针序列 + 后100bp进行引物设计（即基因的1001-1260位置序列）。由于NM_015987基因在探针后只有60bp序列，所以我们只能选择1001-1220区间哦。引物设计时可以采用NCBI的primer，也可以使用primer 5.0或6.0软件设计。这样设计出来的引物即为跨探针PCR引物，如果这段序列设计的引物不合适（例如Tm过高，有二聚体），可以向前或后移动几十bp序列进行引物设计。我们以NCBI的primer设计引物为例，打开NCBI页面，下拉，之后选择Primer-BLAST，

可以获得如下界面，输入我们确定的1001-1220序列，之后在右侧range项输入条件，因为中间的60bp为探针检测序列（101-160bp），如果跨探针需要上游引物在此序列之前，下游引物在此序列之后哦。

继续下拉，会有很多指标可供选择，使用者可以根据自己喜好来调整，调整好后，选择最下面的Get Primers，即可获取引物序列。

点击后输出结果见下 

上图显示共有4对引物可以使用，根据Tm和扩增长度等信息选择自己喜好的引物。例如第一条引物，扩增长度为182bp，Tm为60℃。

通过以上4步即可完成跨探针引物设计哦，是不是很简单呢？期待下次再见~