RNA-蛋白互作研究新方法——XRNAX

研究RNA蛋白互作的又一利器。

 

一直以来，蛋白如何编辑RNA、并使其完成翻译过程，就是转录组学的研究热点。所以，RNA（尤其是miRNA、lncRNA和circRNA）与蛋白相互作用，自然而然成为了科研人员挂在口头、记在心里的宠儿。

然而，目前并没有纯化蛋白-RNA复合物的通用方法，看似巧妇难为无米之炊，但近日cell杂志中的一篇研究论文所带来的新技术XRNAX，为研究RNA与蛋白互作带来了福音！

XRNAX的原理

XRNAX是一种从紫外交联后的细胞中提取蛋白交联RNA的方法。

其原理是：细胞经紫外交联后，在TRIZOL中进行裂解。加入氯仿和相分离后，游离RNA最终进入水相，蛋白质在有机相中，但蛋白质交联的RNA与染色质一起可在间相中被捕获。

XRNAX收集中间相，溶解，并通过DNA酶消化除去DNA，即得到了RNA与蛋白交联的复合物。

XRNAX的优势

XRNAX提取物不含DNA和细胞碎片。这意味着它们可以经受高强度超声而不受RNA以外的大分子的干扰，产生30-80nt片段大小的RNA。

这些片段非常适合于转录应用，如CLIP-Seq。在CLIP-Seq实验中，RNase片段化是导致测序偏差的一个众所周知的原因，并且经常需要费力的去优化实验条件。

XRNAX提取物只含有蛋白质和RNA。这意味着在化学提纯时可以不受通常存在于裂解液中的细胞成分的干扰。例如，蛋白酶K消化和二氧化硅自旋柱纯化的XRNAX提取物可以与NHS-生物素反应，从而标记交联位点。    

        

此外，许多酶反应可以在XRNAX提取物上进行，而不受通常存在于裂解液中的代谢物或洗涤剂的干扰。例如，尿苷酸聚合酶可以在XRNAX提取物RNA的3’端添加生物素化的核苷酸。并且，该提取物可以通过乙醇沉淀。

XRNAX的操作步骤

闲话少说，XRNAX的操作步骤奉上：

1. 细胞数约10⁸个，弃培养基，PBS清洗后冰上对细胞进行紫外交联

2. 细胞刮下来于预冷的PBS中，1000g，4℃离心5min取上清液

3. 加入Trizol吹打裂解，加入氯仿（Trizol体积：氯仿体积=1：0.2）

4. 上下颠倒数次混匀后，室温静置5min，7000g，4℃离心10min

5. 去除最上层水相，注意不要吸去中间相

6. 1ml枪头吸取中间相移至新管内

7. 用TE+SDS 0.1%从界面洗脱残留的水相和游离蛋白

8. 用1ml TE+SDS 0.1 %溶解中间相2次，每次5000g，4℃离心2min后吸去上清

9. 用1ml TE+SDS 0.5 %溶解中间相2次，每次5000g，4℃离心2min后吸去上清

10. 每部分上清液加入60 μl NaCl 5M、1 μl乙二醇和1ml异丙醇

11. 上下颠倒混匀，18000g，-10℃离心15min

12. 弃去上清，70%乙醇清洗沉淀，室温18000g离心1min

13. 加入去酶水，冰上1h混匀

14. 加入200μl DNase，4μl RNase inhibitor消化DNA，吸打混匀后37℃，700rpm孵育 90min

15. 再次异丙醇沉淀，每1ml样品加入60 μl NaCl 5M，1ml异丙醇

16. 上下颠倒混匀，18000g，-10℃离心15min

17. 弃去上清，70%乙醇清洗沉淀，室温18000g离心1min

18. 加入去酶水重悬沉淀，每107个细胞加入1μl去酶水，测浓度后按每μl去酶水1000μgRNA储存于-80℃

参考文献：Jakob Trendel, Thomas Schwarzl, Ananth Prakash, et al. The Human RNA-Binding Proteome and Its Dynamics During Arsenite-Induced Translational Arr est , Cell 2018, DOI: 10.1016/j.cell.2018.11.004

操作步骤详细版网址：https://www./theprotocol