|
滋养层细胞是构成胎盘的主要细胞类型，起源于囊胚的滋养外胚层。目前研究证实，多种转录因子参与了滋养外胚层分化调控，如Tead4、Cdx2 、Eomes、Gata3 、以及AP-2γ （Tfap2c）等。小鼠滋养外胚层细胞中CDX、TFAP2C、GCM1、以及 GATA3等转录因子特异性高表达，而Eomes及Elf5则在胚胎组织中也有分布。近期研究表明，小鼠成纤维细胞过表达Tfap2c、Gata3、 Eomes、以及Myc/Ets2可转化为滋养层干细胞样细胞。 在BMP家族因子（如BMP4、BMP5、BMP10、BMP13等）诱导下，人类胚胎干细胞（ESC）和诱导多能性干细胞（iPSC）可转化为滋养层干细胞样细胞。与原有的ESC或iPSC相比，诱导后的滋养层干细胞样细胞高表达包括CDX2、GATA2、GATA3、TFAP2A、TFAP2C、MSX2、SSI3、HEY1、及GCM1等转录因子，提示这些转录因子对于人类滋养外胚层细胞具有重要作用。但时至今日，滋养外胚层分化调控机制依然是个未解之谜。 德国干细胞研究所的Drukker教授研究组以BMP诱导ESC向滋养层干细胞样细胞分化为体外模型，利用多种组学技术，系统探讨了转录因子在滋养外胚层分化中的调控作用，为相关研究提供了重要线索。 1. 细胞鉴定及转录组学验证 作者所在的研究组在之前研究发现，当采用BMP4处理人ESC48小时后，部分ESC表达表面标记分子aminopeptidase A (APA)，并具有滋养层干细胞特性。因此，APA可用于鉴定并分离滋养层细胞前体细胞。本研究中，作者用BMP4处理人ESC2.5天，并利用流式细胞术，分离APA信号强度最高的20%（APA+）和最低的20%（APA-）细胞进行转录组检测（图1A-C），与未分化细胞（SSEA-5+）进行比对，发现APA+细胞高表达GCM1、TP63、VGLL1、GATA2、GATA3、以及TFAP2C等滋养层细胞特异性高表达转录因子，低表达SOX2、OCT4、以及NANOG等内细胞团特异性高表达转录因子（图1D、E）。单细胞测序结果也显示，APA+与APA-细胞具有不同的表达谱特征，二者可自然分成2群细胞（图1G）。APA+细胞上调表达基因与胎盘组织和多种类型滋养层细胞具有相关性（图1F、H），进一步说明了APA+细胞极有可能是滋养层细胞前体细胞。 图1. BMP4处理人ESC48小时后细胞鉴定分离及转录组特征 2. H3K4me3及H3K27me3组蛋白修饰变化情况 已有研究证实，H3K4me3 及H3K27me3组蛋白修饰的变化在细胞第一次命运决定中具有不可替代作用。本研究利用ChIP-seq方法，探索了上述2种组蛋白修饰在BMP4处理后ESC中的变化。结果发现，在APA+细胞特异性的上调表达的基因约有65%在细胞未分化时（SSEA-5+细胞）同时受到H3K4me3 及H3K27me3组蛋白修饰，但在分化后（APA+细胞）H3K27me3组蛋白修饰丢失，仅保留H3K4me3 组蛋白修饰（图2A、B）。另一方面，研究发现CDX2、GATA3、TFAP2C、GCM1、VGLL1、TP63、以及ELF5等与滋养层细胞分化密切相关的转录因子在未分化ESC中表现为同时受到H3K4me3 及H3K27me3修饰或不受修饰2种形式；而SOX2、NANOG、以及OCT4等内细胞团特异性表达转录因子则在未分化ESC中仅受H3K4me3修饰（图2C-E）。 图2. H3K4me3及H3K27me3组蛋白修饰变化 3. GATA2/3-TFAP2A/C是细胞转化的关键因子 为探索自ESC至滋养层干细胞样细胞变化过程中最关键的转录因子，作者在BMP4处理8、24、48小时后分离APA+细胞，重新比较其中上调的转录因子。BMP4处理8小时后，GATA2、GATA3、TFAP2A、TFAP2C、以及MSX2在APA+细胞中显著上调（图3A-C），提示上述转录因子可能在滋养外胚层早期分化中发挥关键作用。其中MSX2是在多种前体细胞分化中均呈现上调表达，而另外4种则是滋养层细胞分化特异性转录因子。根据以上结果，作者认为GATA2、GATA3、TFAP2A、及TFAP2C很可能是调节滋养外胚层分化最重要的转录因子，并在随后的研究中予以进一步证明。 图3. GATA2/3-TFAP2A/C在BMP诱导ESC8小时即发生表达变化 4. GATA2/3及TFAP2A/C结合位点的确定 作者通过生物信息学预测，筛选转录起始位点-3.4/+5kb处具有GATA2/3或TFAP2A/C结合位点的基因（图4A），并依据该基因在BMP4处理ESC后72小时后是否上调/下调，判断GATA2/3或TFAP2A/C是否对该基因具有转录激活/抑制作用（图4B）。结果表明，上述4个转录因子，特别是GATA3，主要起基因转录激活的作用，进而促进ESC向滋养层细胞分化。所有转录本中发现204个与上述4个转录因子均有结合位点的基因，122个在APA+细胞中显著上调。在122个上调基因中包括11个转录因子（图4C），其中CDX2和ANKRD1是公认的调节滋养外胚层分化的核心转录因子（图4D、E）。 图4. GATA2/3及TFAP2A/C结合位点的鉴定 5. 转录因子GATA3功能验证 为探索GATA3在滋养外胚层分化过程中的功能，作者首先利用GATA3敲除ESC重复BMP4诱导实验，发现GATA3敲除下拨不能被有效诱导为滋养层细胞前体样细胞（图5A）。另一方面，ESC中过表达GATA3可模拟BMP4处理的表型，包括GATA2/3、TFAP2A/C、CDX2、以及GCM1水平上升，以及OCT4水平下降（图5B-D）。恒河猴受精卵中注射GATA3的morpholino可抑制受精卵自32细胞期/桑葚胚期发育至囊胚期（图5E-H），说明GATA3对于灵长类滋养外胚层分化具有关键作用。 图5. GATA3在滋养外胚层分化过程中功能验证 本研究发现由转录因子GATA2、GATA3、TFAP2A、及TFAP2C构成的调控网络介导人类多能干细胞向滋养外胚层细胞转化。该调控网络的启动不仅激活CDX2和ANKRD1等调节滋养外胚层分化的核心转录因子的表达，还抑制了OCT4等内细胞团特异性转录因子的表达。在灵长类受精卵内注射GATA3的morpholino可抑制囊胚形成，进一步证明了该网络对于滋养外胚层分化的关键作用。本研究在组学层面上描绘了滋养外胚层分化的调节网络，为相关研究提供了重要的分子基础。 但另一方面，本研究的发现基于BMP诱导ESC向滋养层干细胞样细胞分化为体外模型，而这一模型本身对于人类胚胎正常发育过程并不能完全模拟。恒河猴虽与人类同为灵长类，但自然状态下二者的滋养外胚层发育并不十分一致。目前人类体外胚胎培养也不能很好模拟滋养外胚层的进一步发育。因此，建立能够良好模拟人类滋养层细胞分化的体外模型，对于该领域的研究具有十分积极的意义。 参考文献： Krendl C, Shaposhnikov D, Rishko V, Ori C, Ziegenhain C, Sass S, Simon L, Müller NS, Straub T, Brooks KE, Chavez SL, Enard W, Theis FJ, Drukker M. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(45):E9579-E9588. 生命树之谜： 中国科学院动物研究所生殖病理学研究组 BOSS简介： http://sourcedb.ioz.cas.cn/zw/zjrc/200907/t20090716_2088415.html Lab简介： http://rpb.ioz.cas.cn/yjz/wangyanling |
|
|
