 ▲上期回顾（点击图片可看大图） 在上一期中我们提到表观遗传学改变包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA作用等，其中DNA甲基化（DNA methylation）是目前研究得最多也是最清楚的表观遗传修饰方式。 DNA甲基化在基因的转录和转录后调控、miRNA基因表达调控和lncRNA的转录后调控中发挥着关键作用，尤其以其调控的多样性、复杂性、功能广泛性和应用价值多样性等特点成为肿瘤的研究焦点。DNA甲基化可在特定组织和发育阶段诱导各种基因的表达模式。 那么到底什么是DNA甲基化？DNA甲基化与癌症又有怎样的关联呢？ DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，DNA的CpG二核苷酸中的胞嘧啶被选择性的添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，常见于基因的5′—CpG—3′序列。哺乳动物细胞内的DNA甲基化主要发生在胞嘧啶和鸟苷酸（CpG）二核酸中的胞嘧啶（C）上，该反应过程是DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到DNA双链中胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）（见图1）。基因组中的CpG约有60%~90%会发生甲基化。  图1 DNA甲基化反应过程 CpG岛（CpG island）是指基因组某些区域CpG序列的密度比平均密度高10~20倍，GC含量大于50%，长度大于200bp的区域。CpG岛的功能是通过甲基化与去甲基化调控下游基因的表达（见图2）。 如果CpG岛发生高甲基化，基因表达就会被完全抑制。CpG岛主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。 人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1Mb就有5-15个CpG岛，平均值为每Mb含10.5个CpG岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。  图2 CpG island功能示意图 DNA甲基转移酶主要有4 种：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 和 DNMT3L。
真核细胞内甲基化状态有 3 种： （1）持续的低甲基化状态，如持家基因的甲基化； （2）诱导的去甲基化状态，如一些发育阶段特异性基因的修饰； （3）高度甲基化状态，如人类女性细胞内缢缩-失活的X染色体的甲基化修饰。DNA甲基化可永久的沉默大量“垃圾”DNA，如病毒感染的重复序列，最常见的有与人类肿瘤相关的EB病毒和HPV病毒：a）EB病毒与人类的多种肿瘤相关，EB病毒感染中的潜伏期与游离表达受宿主细胞DNA甲基化的严格控制；b）与宫颈癌相关的HPV，其在感染的宫颈上皮细胞中HPV-18和HPV-18的甲基化调节和L1开放阅读框区域，参与了促进HPV DNA从游离状态转化到集成状态的过程。 DNA甲基化对基因表达影响的机制：DNA高度甲基化首先会影响DNA结构，进而阻遏基因转录，引起基因沉默。 甲基化会使DNA双链的大沟在三维结构上发生变化，阻滞甲基化敏感的转录因子（TFs，包括E2F、CREB、AP2、cMyc/Myn、NF-k B、cMyb 和ETS等）的DNA结合活性。 与此同时，甲基化不敏感的methyl-CpG结合蛋白（如 Sp1、CTF 和YY1等）会结合在DNA上，这些蛋白是转录抑制因子，它们都含有保守的甲基化DNA结合结构域（methylated DNA-binding domain，MBD）。  图3 哺乳动物细胞内 DNA甲基化对基因表达的影响方式 如图3所示，选择性地结合于甲基化DNA的特异转录抑制子MeCP2（methyl-Cp G binding protein 2），即甲基化CpG结合蛋白，与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）共存于一个复合物中。图上面的基因的启动子（promoter）和转录起始点未被甲基化，尽管基因的下游有碱基被甲基化（有MBD结合），但基因依旧能被转录，而增强子（enhancer）能发挥作用是因为沉默子（silencer）和绝缘子（insulator）被甲基化。图下面基因的启动子和转录起始位点被甲基化，因此不能在起始位点正常转录，同时沉默子和绝缘子与其结合蛋白也发挥作用阻止增强子的活性，而LINE（长散在重复序列）有可能在未被甲基化的情况下进行转录。 在胚胎发生和发展中主要导致基因沉默的变化是CpG位点DNA甲基化，异常的DNA甲基化模式可以导致细胞的癌变。肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体甲基化水平的降低与局部甲基化水平的升高。 研究表明，致癌作用中发生了2个主要的甲基化状态改变：启动子区域的甲基化和全基因组的低甲基化。相较于正常的对应组织，恶性细胞可能在全基因组CpG岛处有20%~40%的甲基化。 目前研究最多的是CpG岛周围的启动子区域的异常甲基化。在肿瘤细胞中，癌基因处于低甲基化状态而被激活，抑癌基因处于高甲基化状态而被抑制。 由异常甲基化引起的特异性肿瘤包括结直肠癌、肾母细胞瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝母细胞瘤、急性骨髓性白血病；MSI的结直肠肿瘤，若是家族性的，可能有生殖系MLH1的突变；若是散发性的，可能存在启动子的超甲基化和MLH1蛋白的表达缺失，其他对甲基化敏感的基因包括RB1\VHL\TP16\BRCA1；研究发现有MGMT启动子甲基化的肿瘤患者比没有甲基化位点的肿瘤患者预后较好；有研究显示，带有BRAF突变的MSS肿瘤通常是高度甲基化的，推测BRAF突变的结直肠癌患者预后差实际上可能是高水平的甲基化和预后不良之间的关系。 DNA甲基化导致肿瘤发生的原因主要有（见图4）： ①DNA甲基化后更易发生基因突变； ②DNA低甲基化会降低染色体稳定性； ③DNA低甲基化可导致原癌基因激活； ④DNA高甲基化可导致抑癌基因失活； ⑤DNA高甲基化可导致miRNA表达缺失。  图4 DNA甲基化导致肿瘤发生的原因 DNA甲基化与肿瘤发生发展有着千丝万缕的关系，提示甲基化可能成为一类新的肿瘤分子标志物。 值得兴奋的是，目前的多项研究的确都证实了甲基化作为肿瘤分子标志物具有无可比拟的独特优势。例如，甲基化在肿瘤早期阶段即可发生并贯穿肿瘤全病程，具有组织特异性，检测的理论灵敏度高等。 肿瘤的病因及发病机制复杂，对肿瘤表观遗传的认识将有助于更好地理解肿瘤的发生、发展机制，从而指导肿瘤的诊断、治疗和预防（见图5）。  图5 DNA甲基化在肿瘤中的应用 目前DNA甲基化的应用主要在癌症的早期辅助诊断和筛查。作为癌症发生的早期事件，异常甲基化检测可以在患者出现临床表现或者影像学证据之前做到分子诊断，为癌症早期诊断提供新的途径。 现己证实肿瘤患者中血清游离含量明显升高，其来源主要有2种机制： ①增殖旺盛的肿瘤细胞持续释放进入血液循环； ②肿瘤细胞的坏死、凋亡或直接入血裂解使血清游离含量增高。 血清游离具有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变（如启动子区高甲基化、基因突变、微卫星不稳定和杂合性缺失等），可间接反映肿瘤的发生发展情况。 2017年Oncotarget上发表的一篇基于浆液性卵巢癌(HGSC)的研究，研究对比HGSC肿瘤组织、无肿瘤细胞的癌旁组织以及配对血液的甲基化改变，发现肿瘤组织与癌旁组织的一致性高达84.9%，表明癌旁组织也发生了甲基化改变，提示甲基化改变发生于细胞癌变（尤其是形态改变）之前（Giannopoulou L, et al. 2017）。使用血清游离DNA甲基化检测在肺癌、头颈部肿瘤、前列腺癌等已被证实可行，是一种可行的具有临床实用价值的早期诊断技术。 体细胞突变主要是检测与肿瘤相关的驱动基因突变，但其不适合作为早筛指标，主要因为： （1）这类突变位点非常少； （2）这些基因片段在血液里的存在比例很低，特别是早期肿瘤患者更低，且严重碎片化，想要捕捉到突变位点就更难。因此，想要检测到肿瘤信号，理论上同时检测位点数越多，检测极限越高，而DNA甲基化信号就更加适合，另外，也有肿瘤基因组研究发现DNA甲基化有可能在体细胞突变之前发生，综上，甲基化更适合用于早期肿瘤的检测。 2015年PNAS，卢煜明教授采用全基因组甲基化测序技术研究了血浆DNA的甲基化模式成果发表，研究对比了孕妇、肝癌患者、肝脏移植和骨髓移植患者的样本，分析了胎盘、肝脏、淋巴细胞和中性粒细胞的甲基化模式，并建立了组织溯源的分析模型。随后分别进行了体外验证和体内验证实验，均取得了良好的一致性（Yuk Ming Dennis Lo, et al. 2015）。体细胞突变如EGFR、KRAS并无显著癌种特异性，不能用于癌症定位，使得DNA甲基化在肿瘤早筛及辅助诊断领域大有可为。 现有研究表明，DNA甲基化还可用于肿瘤的分子分型/病理分型、风险评估、微小残留病灶评估等。DNA甲基化在肿瘤中的具有较大的应用前景，期待技术的商业转化。 注：以上内容根据笔者自己的理解进行整理，若有疏漏异议，欢迎大家留言指正。 主要参考文献： (1) Zhang Y, et al. DNA methylation signatures in peripheral blood strongly predict all-cause mortality[J].Nat Commun. 2017 Mar 17;8:14617. (2) Hao X, et al. DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jul 11 ;114 (28):7414-7419. (3) Moran S, et al. Precision medicine based on epigenomics: the paradigm of carcinoma of unknown primary [J]. Nat Rev Clin Oncol. 2017 Nov;14(11):682-694. (4) Issa J-P. Colon cancer: it’s CIN or CIMP [J] . Clin Cancer Res.2008;14:5939 (5) Giannopoulou L, et al. RASSF1A promoter methylation in high-grade serous ovarian cancer: A direct comparison study in primary tumors, adjacent morphologically tumor cell-free tissues and paired circulating tumor DNA [J].Oncotarget. 2017 Mar 28;8(13):21429-21443. (6) Sun K, et al. Plasma DNA tissue mapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal, cancer, and transplantation assessments [J].Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Oct 6;112(40):E5503-12. Dongfeng Tan, Henry T Lynch. Principles of molecular diagnostics and personalized cancer medicine [M]. 每周讨论 上期讨论解答 讨论：表观遗传药物在癌症治疗领域面临的问题有哪些？ 解答： （1）药物副作用导致正常细胞的死亡，如何降低或哪类药物可以最大限度的降低药物的副作用？ （2）在表观遗传药物作用细胞时是不是主要通过其对于表观修饰状态的改变来达到抑制肿瘤的目的？ （3）是否可通过染色体编辑技术精确改变染色质修饰，以达到治疗疾病并降低副作用的目的？ 表观遗传药物的相关研究和开发必将成为癌症治疗的重要途径。 |
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