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上海交通大学医学院附属新华医院小儿心血管研究团队在学术期刊Genome Medicine（影响因子8.898）上发表了新的内脏异位候选基因的研究成果，阐明新发现的候选基因在左右轴不对称发育中的重要作用。 研究背景 内脏异位（Heterotaxy）是一组广泛累及心脏及众多心外器官的综合畸形，大约90％的Htx患有严重的先天性心脏病。遗传学研究表明是因胚胎期内脏左右体轴非对称结构的无法正常建立而导致的综合征，可分左侧异构及右侧异构。随着对该病认识和检测方法的提高，越来越多的内脏异位综合征被早期甚至胎儿期确诊。目前内脏异位综合征并发心脏畸形的治疗效果并不理想，并且大多数Htx病例的潜在病因和机制仍然未知，因此通过分子生物学的技术探究致病机制尤为重要。 研究思路  本项研究首先对散发的Htx患者进行Affymetrix CytoScan HD芯片分析，发现新的罕见拷贝数变异，然后进一步分析变异片段上的基因寻找可能的致病基因，并通过斑马鱼原位杂交、反义吗啉环寡聚核苷酸基因敲降技术、mRNA过表达、CRISPR/ Cas9技术，阐明候选基因在左右轴不对称发育中的重要作用。 研究结果 1、本研究首次发现Htx患者中的19种罕见CNV，包括5个杂合性缺失，4个基因区段的重复以及10个至少包含一个基因的重复区段。对19种罕见CNV进一步分析鉴定出了6种与左右分化有关的新的潜在候选基因（NUMB，PACRG，TCTN2，DANH10，RNF115和TTC40）。  2、斑马鱼作为一种模式生物用于进一步研究基因的功能。使用地高辛标记的RNA作为探针的WMISH进行斑马鱼两个发育阶段分别是8-10体节期（受精后13-15小时[hpf]）和原基5期（24 hpf，心脏开始搏动）的基因表达模式研究，发现PACRG基因在两个发育阶段均有表达，8-10体节阶段是在KV中表达，原基5期则表达于pronephric duct 和floor plate（图2a，b）。8-10体节阶段numb，rnf115，dnah10和cfap46普遍表达（图2c，e，g，i）；然而在原基5期，这些四个基因表现为更局部化的表达模式：numb和rnf115在大脑中都表达（图2d，f） dnah10仅限于脊索（图2h）， cfap46在floor plate和pronephric duct表达（图2j）。  3、为了进一步研究候选基因的表达对心脏的影响，使用MO敲降技术来处理这些候选基因。在斑马鱼胚胎单细胞阶段注射MO，并且在48hpf评估心脏循环。发现6个候选基因中有5个基因的MO敲降后导致心脏循环发生了显著变化。与阴性对照（2.35％）相比，numb、pacrg、tctn2、dnah10和rnf115的表型差异显著，有13.16-26.2％的胚胎表现出L环或无环（图3b）。DNAH10和RNF115是人和动物中新被发现的的候选Htx基因。CRISPR/ Cas9结果发现明显会导致F0胚胎中异常心脏循环现象（图3c，P <0.001）。基因过表达实验分析对心脏的影响也发现扰乱了心脏循环（图3d）。值得注意的是，rnf115>  4、异常的心脏循环模式可能是由早期常见侧向通路的破坏或特定心脏场效应引起的。基于候选基因的早期表达模式和患者多个器官错位的临床信息，作者假设异常的心脏循环表型是由LR发育过程中早期信号通路的破坏引起的。为了验证这一假设检测了作为18-22体节早期常见侧向通路的标志基因pitx2和lefty2的表达模式。结果发现rnf115 morphants 的PITX2异常表达（28.0％，P <0.001），但lefty2没有异常表达。然后再分析了numb, pacrg,="">  研究结论 罕见拷贝数变异是引起散发内脏异位发生的重要原因。本研究首次发现Htx患者中的19种罕见CNV，包括5个杂合性缺失，4个基因区段的重复以及10个至少包含一个基因的重复区段。对19种罕见CNV进一步分析鉴定出6种与左右分化有关的新的潜在候选基因（NUMB，PACRG，TCTN2，DANH10，RNF115和TTC40）。该研究不仅发现了新的罕见拷贝数变异，更重要的是首次发现DNAH10、RNF115这2个基因参与左右轴不对称发育过程，拓宽了对内脏异位综合征发病机制的认识。通过在斑马鱼中的进一步功能验证，阐明dnah10、rnf115、tctn2、pacrg和numb这5个基因通过影响左右体轴分子标志物pitx2/lefty2的表达模式，进而调控心管的环化。该研究将为内脏异位综合征的诊断与治疗提供理论依据与靶点，进而有望为提高我国人口质量、降低新生儿先天畸形、提高儿童健康水平发挥积极的作用。 参考文献 [1] Liu C, Cao R, Xu Y, et al. Rare copy number variants analysis identifies novel candidate genes in heterotaxy syndrome patients with congenital heart defects[J]. Genome medicine, 2018, 10(1): 40. [2] 孙妍，王健鹏，李慧，等.内脏异位综合征的研究进展.2016,31(2):203-205 |
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