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前文概述了噬菌体展示在生物技术新药研发领域广泛的实践应用和价值，此文续接前文聊聊如何去搭建一个噬菌体展示平台以满足新药研发多方面应用，也就是平台构架的问题。本文以上下两部分简略介绍噬菌体展示的平台构建包括文库的构建，噬菌体文库的扩增展示，淘选方法和筛选方法四个方面，包含信息原理要素，材料要素和过程要素。一个运转流畅的噬菌体展示平台应该是以噬菌体展示技术各个方面的原理地正确理解为指导进行实践操作的结果，从文库构建到拿到确定有功能的特定的抗体可变区基因为止，每个环节都应该有其特定的目标，检测方法和质量评判标准。 噬菌体展示平台实践活动包括文库的构建，噬菌体的扩增展示，淘选方法和筛选方法四个方面，这四个方面是相互关联的，不建议在平台尚未运转流畅的状态下进行信息相对隔离的分工合作，这样会不利于问题的排查。其中噬菌体的扩增和展示在其他三个方面均有涉及，此文相对于其他文献资料将其单列为一个方面的原因是强调其重要性。文库的构建，淘选和筛选可简单的描述为以下三段话 文库的构建 将体外合成或者人/动物的多样化的抗体基因整合到噬菌粒载体或者噬菌体基因组中，使得该基因能够在噬菌体上表达，表达的抗体片段能够和外被蛋白融合得以锚定在噬菌体的表面，形成展示多样性抗体蛋白片段的文库。 淘选 利用靶点抗原或者细胞组织和噬菌体文库作用，淘选出能够和靶点特异性结合或者功能的展示噬菌体，洗脱下来扩增，经过两到五轮淘选，富集和扩增阳性噬菌体文库 。 筛选 对阳性噬菌体文库进行单克隆挑选，通过高通量的测序和功能学实验（ELISA）确定单一的能够和靶点抗原蛋白结合的抗体片段的蛋白序列和基因序列 。 原理 现在普遍应用的噬菌体展示抗体片段的体系称之为3+3体系，3为噬菌体的p3外被蛋白，3+3代表着p3外被蛋白有两个来源，噬菌粒（phagemid）和辅助噬菌体(Helper Phage)。 噬菌粒是一种比较小的质粒载体，在大肠杆菌感受态中有较高的转化效率，并且能够在大肠杆菌中扩增。如下图所示多样化的抗体可变区基因片段可以通过酶切位点整合到噬菌粒中，并能够在成熟p3的N端融合表达，噬菌粒还包含lacZ启动子以调控抗体片段蛋白在大肠杆菌中的表达，以避免可能出现的抗体片段蛋白对大肠杆菌的毒性作用而导致多样性的丧失；抗性基因（通常为青霉素）以维持噬菌粒的筛选压力，His/myc标签为后续的可溶抗体蛋白片段的纯化和筛选检测做准备，amber 琥珀酸终止子在特定的大肠杆菌中终止表达以获得分泌型的可溶蛋白抗体片段。常用的噬菌粒载体包括pHAL30, pHEN and pCANTAB等 噬菌粒只能表达噬菌体的p3蛋白，该p3蛋白均融合了抗体片段，辅助噬菌体则提供了组装成完整噬菌体的结构蛋白包括p3蛋白，其感染包含噬菌粒的大肠杆菌以后，扩增出来的噬菌体其p3蛋白就有概率展示出抗体片段。常用的辅助噬菌体有M13KO7，VSCM13，Hyperphage M13 K07ΔpIII等多种商业化的产品，选择的不同的辅助噬菌体融合蛋白在噬菌体上的展示效率是十分不同的，这个关键的信息往往也是被实验人员忽略的。噬菌体一共有5个p3蛋白，有资料显示最为常用的M13KO7辅助噬菌体其包装出来的噬菌体有90%以上未展示抗体片段蛋白，剩余的10%也仅仅展示1个抗体片段蛋白，为单价态展示；与之相反Hyperphage M13 K07ΔpIII的辅助噬菌体因为敲除了p3蛋白，WB结果显示基本所有包装出来的噬菌体均能够展示抗体片段蛋白，而且基本上均展示3-5，为多价态展示；不同的克隆在相同的辅助噬菌体中有非常大的差异化的展示效率，这些复杂的因素都会对后续的淘选和筛选造成阻碍。一个噬菌体文库中噬菌体是否均展示，是多价态展示还是单价态展示，会给淘选和筛选方案的设计和结果均会造成较大的影响。1一般来讲单价态展示适合筛选得到高亲和力的抗体，而多价态展示能够得到更多的亲和力抗体但在筛选阶段其信号和亲和力的相关性较差。 如下图所示，噬菌体文库的构建大致分为以下流程： 1.从多个捐赠者的外周血或者淋巴组织中抽取总RNA或者mRNA； 2.用随机的六碱基引物将RNA反转录为第一链 cDNA； 3.设计多个引物组合从cDNA库中分别将轻链V片段基因和重链V片段基因复制扩增出来，注意引物的选择会对文库的大小和组份产生偏差性影响，根据B细胞的分化成熟进程，一般来讲针对IgM的引物可能更适合天然文库的构建，针对IgG的引物更适合免疫文库的构建； 4.在之前的引物基础上增加酶切位点，再次扩增从cDNA库扩增出来的轻链V片段基因和重链V片段基因序列； 5.利用overlap PCR 将轻链V片段基因和重链V片段基因序列拼接到一块，包含两者之间的连接的柔性（G4S）n的linker； 6.将拼接好的轻重链整合到噬菌粒载体上； 7.噬菌粒电转TG1感受态，扩增建立噬菌粒在TG1中的库； 8.用辅助噬菌体感染在对数生长期含有噬菌粒的TG1，扩增和纯化得到噬菌体文库。 噬菌体文库的质量评价主要包括文库的大小，文库抗体可变区的多样性，抗体种系（germline）VH, Vκ 和 Vλ基因片段的频次分布等内容，通常通过带抗性的克隆形成实验，测序和高通量测序的结果来评判。以下是几个较为出名和有特色的天然或者合成噬菌体文库的大小信息和文献2，3，4，各位读者可根据对应的文献信息对文库的质量评价体系进行了解学习，本文主要对对噬菌体文库的大小评估和多样性保持进行描述。 噬菌体文库大小 一般来讲一个天然的噬菌体文库筛选得到的抗体其亲和力和文库的大小成正相关，要筛选得到亲和力为nM级别的成药性抗体其文库大小要大于1E10的数量级别。噬菌体文库的大小是由噬菌粒电转到大肠杆菌感受态，在未扩增的情况在氨苄琼脂板上测得的克隆形成数目。需要强调的是商品化的TG1感受态虽然标识的转化效率能够达到>1E10 cfu/ug, 该结果是在特定的质粒载体和10pg质粒电转感受态然后乘以1E5以后得到的数据，实践过程中，根据个人的经验由于单次电转TG1感受态细胞数目和电转后存活的限制，40ul感受态细胞电转最多能够得到的克隆数目在5E7-2E8/次，在噬菌粒的拼接和电转条件均优化较好的情况下构建一个1E10的噬菌体文库需要100次以上的电转。 噬菌体文库多样性保持 文库的多样性一般是由高通量测序抗体重链的CDR3的测量结果来评判, 在重链CDR3的重复性非常小的前提下，文库的大小约等于文库的多样性。相同的道理，包含噬菌粒的大肠杆菌通过感染辅助噬菌体后，扩增后得到噬菌体的数目也不等于文库的多样性，如何保持噬菌粒在TG1中的多样性传递到包装好的噬菌体中并以抗体片段蛋白的展示出来用于后续的淘选?这个需要对噬菌体包装的各个环节进行评估和计算。如下图所示，笔者对一个文献记载的1.2E10大小的噬菌体文库其噬菌体的包装过程进行解析5，在计算之前需要知道的信息，对数生长期的TG1大肠杆菌1 OD600的菌数目是1E9个/ml, 辅助噬菌体有效的感染TG1大肠杆菌需处于对数生长期（OD600 0.4-0.8）,辅助噬菌体感染TG1的MOI一般为10~20：1。该论文中将2.5L的TG1摇菌生长到OD0.5左右，其菌的数目是5E8*2.5E3=1.25E12，在辅助噬菌体感染前，如果保证多样性的不丢失，需要感染的TG1应该是文库大小的10倍以上。鉴于M13KO17辅助噬菌体不到10%的展示效率，在保证噬菌体文库的每个抗体都有10-100个拷贝，在进行淘选时，input进去的噬菌体应该是文库大小的1000倍，即1.2E13。 此文为噬菌体展示原理和实践的第二篇，构架篇上部分。噬菌体展示平台搭建的四个方面中文库构建和噬菌体文库的扩增展示相对联系更加紧密，并在一块进行讨论。构建文库的大小和多样性需要通过文库的展示和扩增得以保持，需要根据已有的信息原理明确其中的多样性传递关系和选择何种辅助噬菌体进行展示。其中以M13KO7辅助噬菌体为代表的单价态展示和以Hyperphage M13 K07ΔpIII为代表的多价态展示将深刻的影响后续淘选和筛选条件的选择，存在噬菌粒的TG1菌库可以选择性的用两种辅助噬菌体进行交替式感染将为后续的淘选方案增加更多的可能性。 实验的方案为实验的目的服务，在噬菌体文库的构建过程中如果实验目的需要筛选中和性抗体如（VEGF抗体），或阻断性抗体（PD-L1抗体）或者亲和力成熟，对抗体的亲和力有较高的要求，单价态展示是更好的选择；如果选择激动性交联抗体（如4-1BB抗体），双抗中的CD3抗体，靶点为线性表位多肽抗体，CART的CAR等需要选择合适的亲和力的抗体或者亲和力较弱的抗体时，多价态展示能够将蛋白间的相互作用由亲和力转变为多价态的结合力，筛选出更多的东西提供更多的选择。噬菌体平台的筛选结果也许在选择辅助噬菌体的时候就已经决定了。 噬菌体展示原理和实践的第三篇，构架篇下部分将从原理和实践中聊聊可供选择的选择压力和如何选择合适的选择压力，设计和优化实验方案以得到满足目的的抗体基因序列。待续！ 希望同行从业者彼此之间能够相互交流讨论磨砺技能，有意者可联系biocommunity@126.com一起交流讨论成长进步，为从业者提供更为贴近实践的技术信息。 参考文献： 1.Rondot S , Koch J , Breitling F , et al. A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display[J]. Nature Biotechnology, 2001, 19(1):75-78. 2.Tiller T , Schuster I , Dorothée Deppe, et al. A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties[J]. mAbs, 2013, 5(3):26. 3.Lloyd C , Lowe D , Edwards B , et al. Modelling the human immune response: performance of a 10 11 human antibody repertoire against a broad panel of therapeutically relevant antigens[J]. Protein Engineering Design & Selection Peds, 2009, 22(3):159-68. 4.Schwimmer L J , Huang B , Giang H , et al. Discovery of diverse and functional antibodies from large human repertoire antibody libraries[J]. Journal of Immunological Methods, 2013, 391(1-2):60-71. 5.Mingqian F, HejiaoB, et al. Construction and next-generation sequencing analysis of a large phage-displayed VNAR single-domain antibody library from six naïve nurse sharks [J]. Antibody Therapeutics, Volume 2, Issue 1, 1 January 2019, Pages 1–11 |
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