噬菌体展示技术与酵母展示技术是目前抗体研发过程中常用的技术,特别是噬菌体展示技术,其对实验设备要求很低,常规分子生物学实验室即可开展该实验技术,加上大容量的文库库容,使得该技术被大家广泛使用。与之相比,酵母展示技术虽然发展了很多年,但是其对设备要求较高,需要配置流式分选仪,流式分析仪等,加上库容量有限,所以目前并未被广泛使用。阿帕克生物核心技术团队从事噬菌体展示技术11年,酵母展示技术4年,本期内容基于我们的从业经验为大家介绍这两种技术的优劣势,供大家在针对不同靶分子与分子需求时更好的去选择研发平台。 图1 酿酒酵母细胞表面结构 图2 不同的酿酒酵母细胞表面展示系统 酵母表面展示主要是通过MACS/FACS来进行筛选,筛选过程采用FACS进行监测,非常直观与方便。 虽然两种展示系统都能够实现基因型与表型的统一,且被广泛应用于抗体开发,但是在蛋白表达系统,库容量,筛选方式等方面,二者存在很大差异。 噬菌体展示文库采用酶切连接或者同源重组,其中酶切连接的方式大家最常用,相对于体外同源重组成本更低。体外同源重组可以大大提高连接效率,但成本非常高。酵母表面展示是将线性化的目的片段和线性化载体按一定比例电转化酵母感受态细胞,片段和载体会在酵母细胞内通过同源重组的方式环化为质粒,成本低廉,操作简单。 酵母表面展示会带检测标签比如HA,Flag,myc等,可以非常方便的通过流式确定文库表达效率,一般展示效率可以达到60%~80%。酵母表面展示是多价展示,一个酵母上大约会有104~105个拷贝。 噬菌体展示承载分子量有限一般将多肽,VHH,ScFv或者Fab 融合到PIII蛋白上, Fab片段对噬菌体就相对较大了。 分子量太大,会影响噬菌体的侵染与包装。然而酵母展示除了可以展示上述的片段外,还可以展示整个抗体IgG分子全长,这是噬菌体展示无法做到。 噬菌体的偏向性非常严重,主要是由3个方面引入的a.噬菌体是原核体系,而抗体来源于真核,由于密码子的偏好性和有些分子对E.coli有毒,导致克隆生长过程中生长速率不一致,甚至导致克隆丢失;b.没有插入片段的克隆,生长速度远远超过插入片段的克隆,导致文库质量降低;c.ORF读码框不正确,也会导致这类克隆生长过快。酵母一般不会存在这类问题,生长相对较均一。 酵母展示最直接的优点是在FACS筛选过程中对选择参数的精确控制。收集的种群百分比,信号归一化,和所需的结合亲和力可以通过流式细胞术划定边界。这种在选择过程中定义结合标准的能力比噬菌体展示平台具有优势,在噬菌体展示平台上,变异识别依赖于洗涤步骤,而不是实时动力学观察。换句话说,在酵母文库选择过程中,这种对理想结合特性的系统性偏向在噬菌体文库筛选中是不存在的。酵母表面展示的筛选方法与流式细胞术提供的定量和多参数分析兼容。可对缓冲液组成、pH、温度和抗原浓度等条件进行精确控制,分选在特定孵育条件下与靶蛋白结合的克隆,如可分选在特定条件下稳定性提升的克隆,同时可以逐个分析文库中的每个细胞,以实时了解展示水平及其抗原结合情况,并分选出特定的细胞群。我们以实际案例来展示酵母筛选的优势: a.基于亲和力的分选 噬菌体筛选高亲和力克隆是通过增加选择压比如包被抗原浓度,洗涤强度等方法,但是却不能进行有效监控,同时筛选到的克隆只能区分阳性,不能分辨亲和力高低,只能在蛋白表达后再做亲和力比较,导致工作量大,成本高。酵母展示是通过将待分选文库经不同浓度的靶蛋白孵育后,在一定的靶蛋白孵育浓度下可区分不同亲和力的抗体展示克隆,并按需求进行分选。如图6所示,分选细胞与不同浓度靶蛋白孵育后的流式图谱,可观察到在11.1nM浓度条件下对不同亲和力的细胞群有较明显的区分,可以按亲和力高、中、低划分不同分选区进行分选,直接分选高亲和力群。这种方式也可以反应出文库中是否有高亲和力的群,以及不同亲和力群的占比。 (1) (2) 不妨点个赞再看亿遍吧~ |
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