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先介绍一下IHC，官方解释：免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的一项技术。作为WB的兄弟，IHC也本着蛋白实验家族一贯的传统，我的实验流程和方法不难，但是想做出漂亮的染色结果却不容易，有条件的实验室可能都会把这个实验外包吧，但是个人认为，IHC是我们必须要掌握的一项技能，动手学一下还是挺有意思的，我们以石蜡组织切片为例： 1) 标本固定 固定的目的：1、使细胞内的蛋白质凝固，减少或终止细胞内分解酶的反应；2、防止组织细胞自溶，保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。 IHC免疫组化，固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10～15倍。 固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，可以根据实验需要切成米粒大小，大小宜为1.0cm X l.0 cm X 0.2cm，组织太大，内部得不到充分固定，会导致组织结构破坏，增加非特异染色，还浪费试剂。同时避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。 2) 脱水、石蜡包埋和制片 用乙醇(由低到高)充分脱水，对于一些质地易脆的组织（如肝、脾等），注意不要在高浓度酒精里的停留过长时间。 组织浸蜡时，一般选用56℃~58℃熔点的石蜡，浸蜡温度最好不超过60℃，防止抗原的损失。 包埋时的操作就考验熟练度了。选择好角度后，动作要迅速，这样才能保证切片时切面完整。但是切片时则要控制好速度，快慢适宜，同时选用完整的刀片，防止蜡带出现划痕。 3)脱蜡和水化 待组织恢复到正常状态，暴露出抗原与一抗结合。如果脱蜡和水化做得不完全，会使后期结果产生非特异性背景着色。脱蜡就是给石蜡切片“脱衣服”的过程，即，用二甲苯将石蜡从切片上“脱”下来，总共脱3次，每次5min。水化，也就是说复水的目的就是利用乙醇的双溶性，使得切片跟后续的水溶性实验体系相容。这一步中，我们使用100%乙醇和95%乙醇各洗切片2次，每次10min。 4) 抗原修复 抗原修复是IHC中极为重要的一步，组织在甲醛或多聚甲醛浸泡固定过程中，会发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇。所以抗原修复是为了使胞内抗原决定族重新暴露出来，提高抗原检测率。 常用的修复方法包括高压加热修复、微波修复和胰酶修复。其中高压加热修复这一方法简便易操作，效果也更好。 使用高压加热修复时，要注意修复的温度和时间，温度越高修复时间越短。修复结束后室温冷却，让蛋白自然复性。同时，为了防止高温时液体挥发，对切片造成不可逆的损伤，应尽量使用过量的抗原修复液。 5) 灭活内源性过氧化物酶和生物素 免疫组化反应容易受到内源性过氧化物酶和生物素的影响，灭活内源性过氧化物酶一般用3%过氧化氢。灭活约10 min左右，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织。此时类似于一张湿转后的western blot膜。 6)血清封闭 为了防止一抗的非特异性结合，造成假阳性，一般会采用BSA、羊血清等封闭这些位点，封闭血清一般是和二抗同一动物来源的，室温封闭10-30 min。 （第一次做免疫组化忘记封闭的结果）
7) 一抗和二抗浓度和孵育时间 不同的一抗浓度，孵育时间和温度等对染色结果都会有不同。在4℃下，反应缓慢，背景较浅；而37℃反应较快，时间较短；室温介于前两者之间，一般情况下，会选择室温孵育就可以。二抗一般室温孵育30 min。 8) 切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗) 为了防止一抗、二抗等残留而引起非特异性染色，建议使用洗瓶冲洗 每次30s，清洗3 次，可用TBST单独清洗一抗孵育后。清洗中要注意每个标本单独冲洗，以防造成污染，同时冲洗力度温和，防止脱片。 9) DAB显色 DAB显色时间不是固定的，可以通过显微镜下观察，控制显色时间，镜下观察出现特异性染色较强而背景着色较浅时即可冲洗。 如果DAB几秒或几十秒就会出现很深的棕褐色，有可能是由于一抗浓度过高，需要适当下调抗体浓度；若很短时间就出现深背景，有可能是非特异性蛋白封闭不全，需要延长封闭时间；若果DAB显色时间超过十分钟才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长。 对于较弱的DAB颜色可以采取增强方法，比如可以选择加入硫酸铜。
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