癌症中免疫激动剂抗体发展的前景和挑战（上篇）

生物_医药_科研 2019-01-17

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过去的四五年时间里，在癌症治疗领域里有一种新药异军突起，它就是PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）抑制剂。在上市的短短三年间，已被美国FDA批准用于包括恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤等近十种肿瘤的治疗。而2018年6月15日，CFDA正式批准了国内首个免疫疗法药物PD-1抑制剂（Opdivo）的上市。PD-1抑制剂的上市及其对多种肿瘤较好的治疗效果给无数癌症患者带来了新希望。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增殖。而PD-1与程序性细胞死亡受体-配体1（PD-L1）结合，可以传导抑制性的信号，降低T细胞的增殖。肿瘤细胞逃避T细胞摧毁的一种途径是通过在表面产生PD-L1，T细胞表面的PD-1识别PD-L1后，可以传导抑制性信号，T细胞就不能发现肿瘤细胞和向肿瘤细胞发出攻击信号。PD-1是通过解除肿瘤细胞逃避免疫系统的免疫疗法，其作用机制是针对PD-1或PD-L1设计特定的抗体，阻止PD-1和PD-L1的识别过程，部分恢复T细胞功能，从而使T细胞可以杀死肿瘤细胞（图1）。

免疫细胞功能受共抑制和共刺激受体的调节。前两代癌症免疫治疗药物主要由阻断免疫检查点的拮抗剂抗体组成，例如PD1和细胞毒性T淋巴细胞蛋白4（CTLA4）。展望未来，用激动剂抗体靶向共刺激受体也有很大的希望，并且越来越多的药物正在经历各个发展阶段。近期GSK公司肿瘤治疗领域的研发人员在Nature Review Drug Discovery发表了综述文章¹，讨论了免疫激动剂抗体设计和开发中的关键考虑因素和潜在缺陷，它们与拮抗剂抗体的区别特征以及在癌症治疗中的应用前景。例如，在T细胞受体（TCR）激活后诱导共刺激受体的时间和持续时间以及细胞上共抑制受体表达的背景可能决定共刺激受体激活是否产生功能响应。

图1：PD1/PDL1抑制剂作用示意图

癌症治疗中的免疫激动剂抗体靶点

目前研究中的免疫激动剂抗体靶点主要属于B7-CD28家族和肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族（TNFRSF或TNFR）。B7家族成员是重要的共刺激分子，属于免疫球蛋白家族，且由结构相关的细胞表面蛋白配体组成。B7可以与淋巴细胞上的受体CD28（Cluster of Differentiation 28）结合，并通过共刺激和共抑制信号调节免疫反应。B7-CD28家族的两种主要共抑制受体，CTLA4和PD1，是第一批成功的癌症免疫治疗药物的靶点，多种药物已被批准上市或处在临床开发的后期阶段。CD28是共刺激受体，是TCR激活后T细胞信号传导的关键介质。在与配体B7-1（CD80）和B7-2（CD86）结合后，CD28激活并驱动T细胞功能、增殖和存活的下游信号。诱导型T细胞共刺激分子（ICOS）是另一种共刺激受体，对于响应ICOS配体（ICOSLG）的活化和记忆T细胞的功能与存活非常重要。早期开发的CD28激动剂会产生严重的临床毒性作用，然而该领域在过去十年里取得了重大进展。因此，CD28和ICOS都是开发用于治疗癌症的治疗性激动剂的靶点（表1）。

表1：临床开发中的共刺激激动剂抗体

TNFRSF是一个功能多样的大型受体家族，其相关结构能介导一系列免疫和非免疫细胞功能。在已知属于该家族的29种受体中，6种受体主要是作为免疫共刺激因子起作用（表1），分别是CD40、OX40、4-1BB（CD137）、CD27、GITR（糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白）和CD30。其他家庭成员，如DR3（死亡受体3）、TNFR1、TNFR2、LTβR（淋巴毒素β受体）和HVEM（疱疹病毒进入介质）也具有免疫共刺激作用的潜力；然而，尚不完全清楚这种共刺激作用的机制，因为它可能因其他功能活动而复杂化，例如在DR3和TNFR1的情况下通过细胞内死亡结构域诱导细胞死亡，或者在HVEM、TNFR2和LTβR情况下与其他TNF配体和受体产生交叉反应²。CD40等6种共刺激受体可以在许多类型的免疫细胞中表达，包括T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞和抗原呈递细胞（APC），并且可以驱动免疫细胞的功能、增殖和生存。死亡受体是TNFRSF中的另一个亚类，在某些情况下它也可以介导免疫活性。然而它们的主要功能是通过细胞内死亡结构域激活细胞死亡，因而研究人员的综述中并没有囊括靶向死亡受体的激动剂抗体。

在这篇综述中研究人员不仅讨论了靶向癌症中免疫共刺激受体的激动剂抗体，也将激动剂抗体与拮抗剂抗体区分开来，突出了激动剂抗体药物相关的治疗前景和发展挑战，而且总结了目前正在开发用于癌症治疗药物的临床背景和组合方法。

激动剂抗体激活靶受体

激动剂抗体的期望特征是具有以模拟天然配体活性的方式结合和激活靶受体的能力。抗体是否可以作为激动剂受许多因素的影响，包括结合表位、亲和力、效价、受体占据程度和抗体可结晶片段（Fc）结构域与Fcγ受体（FcγR）的相互作用等。设计的拮抗剂一般是具有最高亲和力的抗体并且能够与配体竞争性地结合受体的配体结合结构域，而对于激动剂设计则没有硬性规则。详细了解天然配体-受体复合物的结合特性可以帮助我们设计针对特定受体的最佳激动剂抗体。受体的结构、配体结合机制和信号传导机制在受体家族中通常倾向于保守，但是在不同家族之间是非常独特的。因此，我们应该独立考虑两种主要类别的癌症免疫激动剂（B7-CD28和TNFR）的共刺激受体结合和激活的机制。

图2：抗体结构示意图

B7-CD28家族信号转导

B7家族配体（特别是B7-1和ICOSLG）在细胞表面形成同源二聚体的倾向有利于单个配体二聚体与免疫突触的细胞-细胞界面处的两个独立的CD28或ICOS二聚体的二价结合。二聚体B7-1配体与相邻的CD28或ICOS受体二聚体桥接的亲合力作用有助于稳定配体-受体相互作用，导致受体超聚体的形成，随后诱导更有效的共刺激受体信号传导。另外，T细胞活化后免疫突触内的CD28和ICOS受体的隔离可能进一步有助于受体超聚体的形成，并且由于与邻近受体更加靠近，也有助于响应B7配体结合时共刺激受体信号有效地传导。B7配体与CD28和ICOS的二价关联表明，针对这些受体的激动剂抗体必须模拟这种桥接活性以实现最佳受体超聚体的形成和活化。

图3：B7-CD28超家族成员的结构示意图³

CD28和ICOS对T细胞增殖、功能和存活的影响是非冗余的。虽然结合配体后CD28和ICOS都能激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信号通路和活化T细胞核因子（NFAT）信号通路，但是CD28的独特之处在于它还能显著诱导JNK和NF-κB信号传导。CD28和ICOS可以将PI3K的调节亚基募集到其胞内结构域的膜近端YXXM基序，然而ICOS的YMFM基序能比CD28的YMNM基序诱导更强的PI3K信号传导，PI3K随后驱动AKT的磷酸化激活以及NFAT的激活。

此外，CD28膜远端含有富含脯氨酸的基序，这些基序可与含有SH3结构域的蛋白质相互作用，如生长因子受体结合蛋白2（GRB2）和淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK），它们可通过NF-κB、JNK和AP1（衔接蛋白1）复合物介导信号转导。

TNFR家族信号转导

尽管TNFR家族执行了广泛的生物学功能，但受体和配体的结构以及结合和信号传导的机制在家庭成员之间通常是保守的。然而，就序列和三级结构而言，六种TNFR共刺激配体（CD40L、OX40L、4-1BBL、GITRL、CD70和CD30L）是TNF超家族配体中最不同的。与大多数其它家族成员的经典钟形三聚体相比，TNF共刺激配体可以有独特的三级构象。尽管一些TNF配体作为可溶性蛋白产生或被蛋白酶切割释放以充当可溶性配体，但是六种免疫共刺激性TNFR的配体都不是以可溶形式起作用的。已经提出了许多关于TNF配体如何激活共刺激受体信号的机制。一种机制是三聚体TNF配体协调三种单体TNFR结合成3:3构型。然而，即使在没有配体的情况下，一些TNFR主要以预先形成的三聚体构型存在。在这种情况下，TNF配体结合可导致预先形成的三聚体受体的构象变化，导致胞内结构域的信号转导。第三个模型是TNF配体三聚体桥接多个预先形成的受体三聚体复合物，导致受体超聚体的形成或者预先形成的配体超聚体可以结合和介导受体超聚体的形成，这种模型似乎与功能观察更为相符。多个证据表明受体超聚集是介导TNF共刺激受体高效信号诱导的重要因素。研究发现，与膜结合形式相比，一些可溶性TNF配体的激动剂潜力在可溶形式“仅三聚体构型”中显著降低，然而无活性的可溶性配体形式可通过形成能够诱导信号传导的高级寡聚体（含有三个以上的单体）而获得活性。同样用GITRL和CD40L也得到了类似的结论。GITRL和CD40L可能存在二聚体、三聚体和更高级寡聚体并且增加的激动剂活性与配体的高级寡聚形式强烈相关。

天然TNF配体-受体相互作用的结构-功能关系表明靶向共刺激性TNFR的激动剂抗体必须能够诱导信号传导所需的共刺激受体的更高级寡聚化（超聚集）。因此与靶向B7-CD28家族的抗体非常相似，多价结合和诱导受体超聚集的潜力是最佳激动剂活性的关键要素。与主要通过NFAT转录因子转导信号的CD28和ICOS不同的是，共刺激性TNFR主要驱动NF-κB信号传导。共刺激性TNFR通过与六种已知的TNFR相关因子（TRAF）家族成员的差异相互作用激活细胞内的信号传导，每种家族成员具有不同的表达模式和不同的上游和下游介质。TRAF2是最广泛表达的，并且被认为能够与所有六种共刺激性TNFR结合。其他的TRAF与不同的共刺激性TNFR结合，导致重叠但不同的信号模式。TRAF主要通过激活NF-κB抑制剂（IκB）激酶IKK介导NF-κB信号。IκB的磷酸化和降解导致NF-κB易位至细胞核以激活转录。某些TRAF，如TRAF6，还可以通过活化有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶7（MAP3K7）来介导JNK信号传导，或者通过激活其他上游的MAP3K反过来激活JNK信号通路⁴。

结合亲和力，表位和化合价

决定拮抗剂抗体活性的重要生物物理标准（例如受体结合表位和亲和力）在激动剂的设计中也是重要的。然而，驱动拮抗剂抗体设计（高亲和力和配体竞争）的结构-功能关系的一般规则不适用于激动剂抗体设计。目前表位和亲和力在控制激动剂抗体活性中的作用主要在TNFR家族中进行研究，特别是在靶向TNF死亡受体的激动剂抗体中。然而，从靶向死亡受体的激动剂中吸取的经验教训也可以应用于靶向TNF共刺激受体的激动剂抗体的研究中。这些规则如何影响B7-CD28类的激动剂目前还不太清楚，但可以推断这两类受体与基于驱动受体超聚集的形成以诱导激动剂功能的一般原理相似。Chodorge等利用噬菌体研究鉴定了靶向TNFRSF6（FAS）的有效激动剂抗体以及具有FAS亲和力的四种变体，并对其进行激动剂潜力测试⁵。令人惊讶的是，FAS亲和力和激动剂活性之间呈现强烈负相关，最高亲和力的抗体几乎丧失了所有的激动剂活性。然而，通过添加蛋白A交联，激动剂活性增加至组中所有抗体的相似水平，消除了亲和力对激动剂功能的影响。研究表明存在一种抗体结合亲和力与激动剂功能反向相关的模型，而之前也有研究显示靶向FAS的抗体组能够结合相同或相似的表位，但可以导致不同的生物学效应，其中一些作为激动剂，另一些作为拮抗剂。虽然表位不能预测功能，但相对的结合亲和力确实与FAS的激动剂活性呈负相关。这些研究虽然证明亲和力对于实现激动剂功能的重要性，但也清楚地表明单独的结合表位并不能决定前者的功能。激动剂抗体通常显示与其靶受体的配体结合表位有部分或相当程度的重叠。然而，也存在激动剂抗体几乎不与配体结合结构域重叠并且结合受体可以与天然配体完全不同。Bjorck等研究发现靶向CD40上不同表位的多种抗体能够引起激动剂信号的激活。事实上，有两种抗体在一起使用时协同作用CD40信号传导但在与CD40L组合使用时不协同作用⁶。在这些情况下，激动剂抗体在受体活化模式方面可能与天然配体不同。替代性激动剂作用模式可包括优先结合并稳定预先形成的受体寡聚体（图4a）。因此，激动剂抗体的受体结合表位可能是负责信号传导活性的重要因素。然而对于单个受体来说，可能存在不止一种能够实现激动剂活性的结合表位。因此，孤立的受体结合表位不能预测抗体的激动剂潜力。

抗体诱导受体超聚体形成的能力对于共刺激激动剂功能是至关重要的。因此，天然免疫球蛋白G（IgG）的二价是必须保留的关键生物物理特征。通过两个抗原结合片段（Fab）桥接多个受体可导致单体-单体相互作用或更高级（大于两个）簇的形成，其不同于拮抗剂抗体的是拮抗剂抗体的设计中单价结合抗体或抗体片段可以作为有效的拮抗剂。这种差异对于双特异性抗体的设计具有重要意义。

目前已经研发出IgG样双特异性抗体，其中的单个IgG可通过具有不同抗原特异性的两个Fab臂结合两种不同的受体。这种形式具有同时阻断两个轴（拮抗剂-拮抗剂配对）的潜力，每个拮抗剂Fab与其各自的靶受体形成单价结合相互作用。不太清楚的是激动剂-拮抗剂或激动剂-激动剂配对是否也可以以这种形式实现。有一些TNFR家族成员能够形成混合寡聚体转导信号，与单个共刺激受体的同源二聚化相比，抗体诱导的不同共刺激受体的异二聚化是否可以诱导相似的或协同的激活也是个有意思的问题。通过产生针对4-1BB和OX40的激动适配子以及包括CD40L、4-1BBL和OX40L在内的可溶性重组形式的共刺激性TNF配体已经证明了多价对于激活共刺激受体的重要性，其中配体融合的高级寡聚体或交联三聚体能够比天然可溶性三聚体形式或单体形式诱导更显著的TNFR激活。

激动剂抗体Fc结构域与FcγR结构域的相互作用

尽管激动剂抗体中Fab结构域的靶向结合特性是关键的因素，但抗体Fc结构域和FcγR（IgG Fc段受体）之间的相互作用也可以决定激动剂的潜力，而现在也将FcγR结合理解为实现最佳共刺激激动剂抗体功能的必要条件。人抗体和FcγR之间的相互作用是非常复杂且有细微差别的。人有六种已知的FcγR，五种激活的（高亲和力免疫球蛋白γFcRI（FcγRI）、低亲和力免疫球蛋白γFcRIIa（FcγRIIA）、低亲和力免疫球蛋白γFcRIIc（FcγRIIC）、低亲和力免疫球蛋白γFcRIIIa（FcγRIIIA）和低亲和力免疫球蛋白γFcRIIIb（FcγRIIIB））和一种抑制的（FcγRIIB），所有这些都能与具有不同特异性和亲和力的四种人IgG（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）结合。FcγR在人不同类型的细胞（特别是免疫细胞）中的差异表达进一步增加了复杂性。许多研究证明FcγRIIB为共刺激受体如CD28、CD40、OX40和4-1BB以及死亡受体DR4、DR5和FAS的最佳激动剂激活所需。激动剂功能不太可能通过FcγRIIB的细胞内信号传导介导，相反的是激动剂活性似乎是通过受体的支架和锚定活性或通过增加的受体交联潜力介导的（图4b）。此外，激活的FcγR也可以诱导IgG的交联和激动剂功能。然而体外免疫细胞实验和体内模型研究表明FcγRIIB介导交联增加的潜力是由于FcγRIIB表达细胞（主要是B细胞）中相对高的表达和可用性。在激活FcγR后，诱导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）使解释这些受体能否介导交联和激动剂激活变得更加复杂。

图4：用共刺激激动剂形成受体超聚体的机制。

a|抗体结合亲和力可与激动剂功能负相关。在该激动剂抗体激活模型中，抗体的部分解离使得单个抗体的抗原结合片段（Fab）臂以动态方式与两个以上受体相互作用，导致多个受体单体募集到受体寡聚体中，其中可以触发信号激活（左侧）。在共刺激受体激动剂激活的另一个模型中，抗体优先结合并稳定预先形成的受体寡聚体，将平衡从单体形式向受体寡聚体形式（图中显示为TNFR三聚体，但也可能是B7-CD28二聚体）转移（右侧）。b|在APC上表达的FcγR充当支架以交联激动剂抗体和共刺激受体的结合，导致受体超聚体的形成和激动剂信号传导的增强。

有趣的是，针对多种免疫共刺激受体（CD40、4-1BB和CD28）的人IgG2抗体似乎能够以FcγR非依赖性方式诱导激动剂激活，推测是由于铰链区二硫键的重排导致的动态构象导致的。IgG2b的Fab臂与铰链区二硫键连接，导致FcγR非依赖性激动剂功能。在抗CD40激动剂抗体CP-870893（Roche开发的IgG2激动剂抗体）的案例中，不需要Fc交联，而抗体识别的CD40表位才是效力的关键决定因素。针对癌症中共刺激受体的很多药物正在开发中，因此进一步了解人IgG2抗体的FcγR非依赖性激动剂活性的功能相关性将是重要的。人IgG2同种型是否消除了与人FcγR表达细胞相互作用的结合需要以及对抗肿瘤活性和毒性的影响可能会影响未来激动剂抗体的发展。提高抗体激动剂潜力的其他策略包括抗体工程方法，以增加天然IgG对FcγRIIB的亲和力，因为天然IgG对FcγRIIB的亲和力相对较低，在一些研究中，FcγRIIB增强的抗体相对于天然IgG显示出改善的激动剂潜力。