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杨柳a 翻译；邓艳红a 审校 a 中山大学附属第六医院肿瘤内科 要点 引言 迄今为止，癌症研究在确定主要治疗靶点方面取得了重大进展，然而，由于肿瘤遗传异质性的存在，任何治疗只对部分肿瘤细胞有效，并没有通用的可显著减少或消除癌症的治疗方法。 肿瘤活检可以提供有价值的信息，然而，这种方法有很多缺点，例如它的有创性和无法捕获基因表达的所有变异性。 由于癌症死亡的主要原因是转移，任何治疗的有效性只能通过阻止或延缓转移的发生。为了达到这个目的，准确尽早发现肿瘤状态是关键。 液体活检依赖于收集外周血来筛选循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）和/或循环肿瘤DNA和RNA（circulating tumor DNA and RNA，ctDNA/RNA），检测到独特的癌细胞蛋白（源自CTC）或致癌突变和表观遗传变化（来自CTC或ctDNA/RNA）可能有助于寻找消除和抵消抗癌治疗的最有效武器；其通过遗传进化以适应任何治疗。 这篇回顾性分析主要讨论了研究CTC循环肿瘤标志物和ctDNA/RNA及其对临床实践影响的重要性。总的来说，作者主张用液体活检来筛选CTC和ctDNA/RNA作为确定肿瘤进展和提供个性化治疗的手段。 根据从CTC和ctDNA/RNA中收集的信息，我们可以实时了解肿瘤正在发生的变化，包括CTC数量、CTC基因表达、ctDNA中可能的激活突变，可能促进肿瘤生长的miRNA，以及从循环中捕获的RNA转录物。图1所示为液体活检的来源和其他相关因素。 图1. 循环系统中许多与维持原发/ 局部病灶持续生长有关的因素。包括变成侵袭细胞的CTC、外泌体、ctDNA/RNA 等。CTC 可以在远处粘附，并形成继发性病变。液体活检，通过简单的抽血检测CTCs、ctDNA 水平的变化及其基因和表观遗传学的组成来预测这类事件。 CTC 检测 CTC分离的首要目标是准确区分CTC和血液中其他类型的细胞。基于抗体选择或细胞大小筛选技术的发展共同推动了CTC分离技术的进步。许多方法依赖于微流体技术来实现。 CTC是非常罕见的且具有异质性的，通常每10 ml血液有1~10个CTC细胞。这些细胞的稀缺性对检测技术提出了挑战。基于抗体的选择，理想的标记是CTC相关的蛋白质，在任何其他类型的循环细胞上都检测不到：类似于免疫细胞CD45的标记。 FDA批准的CellSearch系统已经被广泛使用，并成为其他CTC分离技术的参考标准。 许多研究已经在多个瘤种中应用CellSearch检测来预测肿瘤转移、无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）。有些分离技术声称可以更快的处理样品，并能通过使用多种方法/靶点进行更好的筛选。这些分离CTC的方法总结如下（图2和表1）。 图2. CTC 分离方法和循环ctDNA / RNA 组成部分。可以使用多种技术处理血液样品进行CTC 分离，如图所示。样品的血浆部分还含有各种类型的遗传物质，例如循环肿瘤微循环RNA、ctDNA 和lncRNA。 这些分子可以包含或不包含在外泌体微囊中。 CTC 的临床应用 已有许多临床试验通过测定CTC数量来预测各种肿瘤患者的OS及PFS。一项前瞻性研究收集了330例Ⅰ~Ⅲ期非转移性乳腺癌患者，发现其中73例CTC阳性（至少有1个CTC）的患者，其PFS及OS均比未检测到CTC的患者更短。而且，CTC 数量超过2个或3个的患者的PFS及OS的预后都明显比未发现CTC 的患者更差。 尽管这些研究结果证明了CTC判断预后的潜力，但是这些研究都没有发现CTC数量与病理淋巴结状态的相关性。 有趣的是，SWOG研究和Rack等人都没有发现激素受体状态与CTC数量之间存在联系。可能由于激素状态并不是早期阶段的事件，通过CellSearch系统（以上皮标记物EpCAM为靶点）收集CTC的方法，可能略掉了间质细胞，后者更可能反映肿瘤的受体的状态。 由于CTC已经成为判断乳腺癌OS和PFS预后的科学验证指标，正在进行新的临床试验将利用CTC计数指导临床决策。这些试验将评估CTC计数作为指导患者临床治疗决策的价值。 除了乳腺癌外，转移性CRC患者的多中心研究发现，基线时和治疗后CTC计数≥3个是PFS和OS的重要预测指标。对于需要长期化疗的转移性神经内分泌肿瘤患者的分析发现，在基线和治疗第一周期后未检测到CTC是OS和疾病进展的强力预测因子。在基线和第一个周期治疗后CTC计数下降50％的患者也是如此。 新一代固定/捕获CTC的设备在遗传分析中的应用，开创了一个研究这些肿瘤细胞的新领域。或许是为了了解CTC中有突变而原发性肿瘤未观察到的突变之间的相关性，Caroline Dive博士的研究团队开创了一种独特的方法，即CTC衍生异种移植（CDX）模型。从本质上讲，这些CTC是从外周新鲜血液中捕获，并立即对NSG小鼠皮下注射。由此所生长的肿瘤显示与CTC具有相似的基因组特征，并反映与来源NSCLC和黑素瘤组织相当的药物/治疗反应。 总体来说，与ctDNA分析相比，CTC的基因组分析仍然比ctDNA成本更高，时间更长，且与其有大部分重叠的地方。 循环肿瘤DNA 循环DNA可以来源于肿瘤细胞、外泌体、或者见于无细胞DNA（cfDNA），这些都通称为ctDNA，尽管cfDNA可以包括非肿瘤相关的DNA。到目前为止，检测循环DNA的技术还不够敏感。cfDNA是一种长约140~170个bp的片段蛋白，它最初的形式是一个组蛋白的核苷酸。这些DNA片段维持原发肿瘤的表观遗传标记，这是推动ctDNA分析的一个重要因素。 循环肿瘤RNA 循环转录RNA由编码和非编码RNA组成，如miRNA。与其他形式相比，microRNAs由于其体积小而通常在循环中更稳定。循环RNA的关键来源包括肿瘤细胞外泌体和微粒体，以及TEPs。 一些研究也关注转录组的单细胞测序。其他许多研究集中在分析稳定和游离RNA（cfRNA）。在一项研究中，研究人员观察了血浆中cfRNA和端粒特异性逆转录酶mRNA水平，结果表明两者均与直肠癌接受放化疗肿瘤反应相关。 多项研究也确定了腺瘤和结肠癌的miRNA谱。癌症患者外周血中的cf-microRNA可能反映其对肿瘤生物学的影响以及治疗，有助于诊断，判断预后和治疗反应。已经发现了很多由不同组织来源的肿瘤组成的各种miRNAs谱。基于此建成了多个数据库，例如miRCancer Database mircancer.ecu.edu，microrna.org，mirbase.org以及ncbi.nlm.nih.gov/nuccore等等。 这些数据库列出了各种肿瘤特异性miRNA的概况和潜在的影响。 外泌体 外泌体的含量包括蛋白质、脂质、DNA、mRNA和LincRNA。 外泌体由包括癌细胞在内的多种细胞分泌；外泌体修饰过程包括细胞免疫、对感染的应答和肿瘤发生。 外泌体在肿瘤进展中的功能，一定程度上能通过肿瘤衍生的外泌体对远位点的宿主微环境的调节能力来解释。这些发现形成了转移前的微环境概念。例如，给未接受过任何处理的小鼠注射黑色素瘤外泌体，结果显示在没有任何肿瘤细胞之前在转移前生长位点有新血管生成。 外泌体的蛋白质组学分析揭示不同的整合素表达模式可能指示外泌体优先靶向特定细胞类型或器官。整合素α6β4和α6β1与肺转移相关，而外泌体整合素αvβ5与肝转移相关。 靶向这些整合素有可能降低外泌体摄取以及肺和肝转移。 肿瘤细胞形成外泌体也可能影响对治疗的反应。例如，在B细胞淋巴瘤患者中，肿瘤衍生的外泌体表达CD20以抵抗利妥昔单抗在体外和体内的靶向免疫治疗。使用环氧合酶2型抑制剂吲哚美辛的ATP结合转运体A3（ABCA3）的药理学阻断抑制外泌体释放，从而减少CD20-携带外泌体的贮槽效应并增强利妥昔单抗的功效。 总之，上述研究提供了外泌体对癌症病理学机制的一些见解。继续研究外泌体的性质可更好地了解它们的作用。 ctDNA/RNA 的临床应用 液体活检的一个主要优点是相比原发性肿瘤组织活检的创伤性更小。能多次利用，包括分析组织的分子谱，监测对治疗的反应，检测最小的残留病灶和治疗后的肿瘤进展。 对于阳性生物标志物，发生突变与靶向治疗的反应相关，ctDNA的表现已经足以融入临床实践。在欧洲，更新了吉非替尼的监管策略，在无法获得肿瘤组织样本的患者中允许使用ctDNA测试EGFR突变情况。EGFR TR790M抑制剂Rociletinib（CO-1686）正在由FDA进行优先审查，初步研究对T90M突变的检测基于组织和血浆。虽然还未包括在美国的药物管理之中，但是由多家公司提供的类似ctDNA检测在临床中的应用，已经为保险公司提供了充分适合治疗的标准。 KRAS或NRAS突变是EGFR抑制剂治疗用于治疗CRC的负性生物标志物，相对在临床工作中的应用更慢，一定程度上是由于对假阴性怀疑和方便对肿瘤组织样本进行再次检测。尽管如此，为了改善时间周转和样本可用性，研究者正在努力开展ctDNA测试。 目前，对ctDNA检测的临床应用也在不断增加，病人和医生也在努力确定靶向治疗和临床试验外更加有针对性的治疗方法，这是通过新一代测序技术（next generation sequencing，NGS）的发展而得以实现的。 非外泌体ctDNA的半衰期据估计有几个小时，为此对肿瘤进行监测、治疗反应和手术效果的提供了机会。在CRC中，例如后来经过影像学证实疾病部分缓解的患者在治疗2周后>90％的ctDNA水平降低。这种快速清除已经被用来判断根治性切除术后肿瘤的复发风险。这些生物标志物正在整合进入前瞻性临床试验。 通过外周血ctDNA对诊断、监测和治疗过程的系统检测，可以得出循环中肿瘤大分子的变化谱。循环基因组和转录组的瞬间情况更能代表肿瘤不同区域的异质性。这有助于比组织活检更早地确认和发现治疗耐药性的出现。 图3. 液体活检包含了大量与肿瘤状态、转移潜能和复发可能的相关信息。这些液体活检的评估因素包括CTC 计数、CTC 基因图谱和蛋白质表达、ctDNA/RNA 的水平以及已知突变或表观遗传特征的存在或缺失。通过液体活检中的这些因素对癌症患者进行全面的分析，可以为个体化治疗提供基本信息。 图3显示了可从液体活检中获取各种信息。目前各种临床研究试图证实液体活检的作用及效果。目前可用的临床数据和正在进行的试验包括多个具有其特异性肿瘤特征和信息生物标志物。 这些提出假设、由研究者发起的研究显示早期检测遗传突变的潜在益处。我们相信技术的进步和大量应用这些技术在未来癌症治疗和个性化治疗的过程中将会发挥很大的作用。 总结和未来展望 本文讨论了个性化治疗的三个生物标志物来源。展望未来，我们设想，每个生物标志物都可以用作全面评估预后、治疗疗效和复发风险的微创手段。总体而言，我们预见随着对液体活检CTC、cfDNA/RNA，以及外泌体了解的不断加深，通过液体活检将帮助我们更快的实时了解肿瘤状态并提出解决策略。 |
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