三分钟带你看懂液体活检

液体活检是指利用人体体液作为标本来源进行检测和分析的体外诊断技术。肿瘤细胞在发生凋亡或转移等过程中会将与肿瘤相关的信息如DNA/RNA等小分子物质释放到体液系统中，通过检测这些标志性分子，可以发现肿瘤的早期发生/复发、辅助诊断分型及治疗方案调整，相对于组织活检具有无创性、患者依从性好、可动态监测等优点。更重要的是，液体活检克服了肿瘤的异质性这一难题。

液体活检的临床应用^[1]

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应用方向

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检测对象

液体活检的检测对象主要为体液标本中的核酸、细胞和外囊泡。核酸指cfDNA/cfRNA（circulating free DNA/RNA，循环游离DNA/RNA，包括ctDNA/ctRNA）；细胞指 CTCs（Circulating Tumor Cells，循环肿瘤细胞）；外囊泡指含有小RNA、mRNA和DNA的细胞外微囊泡，包括外泌体（Exosomes）。

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检测方法

液体活检的前提是寻找到有“意义”的微量ctDNA。实验室常用的ctDNA 检测技术包括扩增受阻突变体系（amplification refractory mutation system， ARMS）、二代测序（next-generation sequencing，NGS）、数字PCR（digital PCR，dPCR）和核酸质谱检测等。在实际的样本中，ctDNA的含量仅占cfDNA的0.1%-5%,因此，要求检测技术有足够低的检出限和灵敏度才能满足液体活检的检测需求。

Table 1 ctDNA检测技术比较

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标本要求

用于液体活检的标本有多种，包括全血、血浆、胸/腹腔积液、尿液、脑脊液、唾液等，检测时，根据肿瘤的具体发生部位、转移情况的复杂性、不同体液标本的特征，应优先选择液体活检靶标最易检出部位的标本。血浆ctDNA 样本适用于检测各种来源的肿瘤，已在肺癌^[4]、乳腺癌^[5]、淋巴瘤^[6]等肿瘤的液体活检中有所应用。

体液中存在较强的背景干扰，加之液体活检的信息源极其微量，易在分析过程中出现偏差，因此液体活检对分析全过程的要求相对较高，尤其在标本预处理步骤需避免背景细胞或核酸对CTC和ctDNA的稀释作用，同时进一步防止对CTC 的破坏和对ctDNA的片段化及降解，导致最终假阴性结果。

Table 2 体液标本选择一般规律^[7]

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液体活检与组织活检

临床研究表明，患者体内肿瘤细胞呈现很强的异质性，即肿瘤患者体内存在多种肿瘤细胞亚克隆，不同肿瘤细胞的基因突变类型不同，往往对同种治疗方案的响应不同。在临床诊断上，获取患者体内肿瘤细胞的综合信息是精准医疗的基础。液体活检和组织活检在检测上各有优势和不足，二者相互补充，可为临床提供综合全面的肿瘤基因信息。

与传统的组织活检相比，液体活检凭借其无创性、敏感性、动态性等特质，被寄予厚望。尽管目前ctDNA检测存在重复性不佳、不同实验室间检测结果一致性较差、检测结果在不同实验室间互换性低、准确性低等缺陷，制约了ctDNA在临床实践中的应用，但通过提高数据覆盖度、添加分子标签等方法，可有效提升液体活检的准确性和一致性。

临床研究案例

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ctDNA监测：比影像学提前5.2个月发现肿瘤复发^[8]

通过基因检测等方式，对肿瘤患者血浆/血清里的ctDNA进行基因分析，从而协助肿瘤诊断、协助靶向药的选择、协助肿瘤负荷的监测，是近年来的研究热点。

Cancer Discovery(IF:26) 2017年发表研究结果：应用二代测序分析ctDNA能够有力地识别局部肺癌患者的治疗后MRD，比放射成像更早地发现肿瘤的残留/复发，从而在疾病发生早期促进个性化的辅助治疗。

研究者对37位治疗后的肺癌患者同时应用横断层面成像和ctDNA进行监测。有20位患者（54%）在治疗后均检测到ctDNA，且这20名患者后来均复发了。研究者表示，根治性治疗结束后早期即可测到ctDNA的患者，更容易出现复发，这部分患者的生存期也明显缩短（Figure 1）。定期接受ctDNA监测的患者，第一次检测到ctDNA的时间，比CT片子上明确提示肿瘤复发，平均提前了5.2个月。

Figure1 检测到ctDNA突变的患者（n=20）与未检测到ctDNA突变的患者（n=17）的生存情况.

ctDNA进行深度的基因分析，发现20%的患者可以找到特效的靶向药、33%的患者可以对应到合适的免疫治疗方案。

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液体活检比CT早约4周检测到患者的靶向药物治疗效果^[9]

2019年3月发表在国际知名学术期刊Cancer Research（IF:8.4）上的一项临床研究证实，基于血液的液体活检能精确的追踪肺癌靶向药的治疗效果。研究人员对28例接受EGFR抑制剂或HER2抑制剂进行靶向治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的血液样本进行检测，用以评估ctDNA的变化是否能够作为一个实时的评估靶向治疗疗效的分子标志。

研究者对患者使用TKI抑制剂治疗开始和中期及后续的几个时间点的外周血样本进行检测，使用二代靶向测序，包含58个基因，测序深度大于3000×；同时，应用全基因组测序方法验证cfDNA的拷贝数变化。

Figure 2 cfTL检测及疗效预测示意图

结果发现，在这28位患者中，有20例在接受治疗后一周，血液样本中能够检测到的ctDNA就几乎完全消失，说明药物对这部分患者完全生效，可以继续使用该靶向药物。而余下的8例患者的ctDNA水平仅出现了有限的变化，这说明对治疗无响应，并且后期证实这些患者的无进展生存时间明显更短；而这些患者在第5-7周时，CT才显示出病灶变化。

这项研究说明通过对ctDNA进行检测，分析ctDNA总体水平，可以达到在治疗期间对肿瘤负荷进行实时跟踪的目的，可以及时获取药物的治疗效果等信息。

THE END

液体活检在肿瘤早筛、诊断分型、早期复发监测等方面无疑都有其独一无二的优势，通过技术的不断改进，成本不断降低，未来也必定能惠及更多患者。尽管液体活检在近年来发展迅猛，但液体活检不会也不能取代组织活检。组织活检和液体活检是互补的方法，配合应用可以整合不同的信息，帮助临床医生做出更准确的判断。