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Lymphocyte activation gene-3（LAG-3,淋巴细胞活化基因-3）是一种由498个氨基酸构成的I型跨膜蛋白，选择性表达在活化的T淋巴细胞、NK细胞和树突状细胞上。LAG-3蛋白由4种具有高度同源性的胞外免疫球蛋白超家族类似（IgSF-like）结构域（D1-D4）组成，其对T细胞的调节功能与PD-1类似，主要作为递送抑制信号的受体起作用。 目前大多数科学家认为MHC-II是癌细胞用来结合LAG-3分子从而降低T细胞活性的主要配体，因此靶向MHC-II将有助于激活T细胞的抗癌能力，然而，几种不阻断LAG-3与MHC-II结合的单克隆抗体却表现出了激活T细胞的能力，例如，针对鼠LAG-3 D2结构域的特异性单克隆抗体C9B7W在体外和体内表现出了增强T细胞的增殖和效应功能。因此研究人员认为LAG-3的免疫功能可能通过其他未知配体介导，在这篇文章中，陈列平教授团队证实了纤维蛋白样蛋白1（FGL1）是一种独立于MHC-II的LAG-3的主要功能配体，揭示了一种新的免疫逃避机制。 文末有福利，记得认真读完喔！ 研究人员利用基因组规模受体阵列（GSRA）技术，用免疫球蛋白（IG）Fc标记的LAG-3胞外结构域融合蛋白（LAG-3-IG）搜索LAG-3结合蛋白（图1A），在GSRA系统中，FGL1被鉴定为LAG-3-IG的主要结合蛋白。图1B为GSRA系统中FGL1-LAG-3相互作用的图像，结果显示在人类和小鼠不同的特异性环境中，FGL1-LAG-3相互作用都十分稳定，这种相互作用通过流式细胞术得到进一步验证，在LAG-3+细胞上，FGL1-IG和anti-LAG-3染色之间存在线性关联（图1C）。生物膜层干涉分析结果显示，FGL1-LAG-3相互作用的Kd值为1.5Nm，且缓慢的解离速率也表明FGL1和LAG-3之间可能存在稳定的相互作用（图1D）。 LAG-3蛋白由四个免疫球蛋白样胞外结构域D1-D4组成（图1E），通过删除特定结构域实验，结果显示LAG-3中D3-D4结构域的缺失不影响FGL1结合，而D1或D2结构域会降低其结合率，说明D1和D2都参与了FGL1-LAG-3的相互作用。此外，研究人员还通过单点突变（Y73F）先破坏MHC-II与LAG-3结合，其结果显示这一突变并不影响FGL1-IG与LAG-3结合，表明FGL1-LAG-3的相互作用与MHC-II无关。 研究人员通过体内外实验进一步验证FGL1是LAG-3的主要抑制配体。图2A通过流式细胞分析结果显示，FGL1-IG融合蛋白结合了野生型小鼠（WT）的的活化T细胞，而不与LAG3-KO小鼠（LAG-3基因敲除）的T细胞结合，且图2B结果显示，加入FGL1-IG融合蛋白，抑制了WT小鼠T细胞的增殖，而LAG3-KO小鼠可以降低FGL1-IG融合蛋白的抑制作用，这些结果共同说明了FGL1-IG的抑制作用依赖于LAG-3的存在。同样地，与内源性LAG-3表达较低的亲本3A9细胞系相比，FGL1能更好地抑制了过度表达LAG-3的3A9-LAG3细胞系对IL-2的诱导（图2C）。研究人员通过表达了两种单克隆抗体anti-FGL1和anti-LAG3，结果显示，在3A9-LAG3细胞中，两种单克隆抗体都消除了FGL1对IL-2产生的抑制作用（图2D），以上结果进一步说明FGL1是LAG-3的主要抑制配体。 研究人员通过基因敲除技术，获得缺少FGL1基因的小鼠（FGL1-KO），FGL1-KO小鼠整体外观、器质和窝仔均正常，说明FGL1不影响小鼠的生长发育。然而，高达40%的FGL1-KO小鼠在8个月或更大的年龄出现自发性皮炎，出现真皮内淋巴细胞浸润，14-16个月的5/8雌鼠的血浆中自身抗体水平明显增高。 研究人员通过对CD45+造血细胞总数的分析，发现了22种不同的细胞类型，中央记忆细胞（如CD8+T细胞亚群，簇14-15）出现增加的趋势，而B细胞亚群（簇2和簇4）呈现减少的结果（图3A-3E），这些结果表明内源性FGL1不影响小鼠的发育和生长，但可能参与了老年小鼠自身免疫调节和免疫稳态过程。 研究人员用同源小鼠MC38结肠癌细胞皮下接种FGL1-KO和LAG-3-KO小鼠，结果显示，与对照组WT小鼠相比，FGL1-KO和LAG-3-KO小鼠肿瘤生长缓慢（图4A）。MC38接种后，WT小鼠的生存期为60天，而50％的FGL1-KO或LAG-3-KO小鼠在200天后没有检测到肿瘤细胞（图4B）。除此之外，研究人员还进一步证实了加入抗FGL1和抗LAG-3单抗均能显着地控制MC38鼠结肠的肿瘤生长（图4C），而在缺乏T和B细胞的Rag1-KO小鼠中，抗FGL1和抗LAG-3单抗则无法实现抗肿瘤作用（图4D）。图4E显示抗LAG-3单抗在WT小鼠中可以抑制MC38肿瘤生长，但在FGL1-KO小鼠中却没有实验这种抗肿瘤作用，图4F中也表明该单抗对LAG-3-KO小鼠中的肿瘤生长没有累加效应，其结果都说明了抗FGL1单抗的抗肿瘤作用依赖于LAG-3，而抗LAG-3依赖于FGL1而不是MHC-II或其他配体，再次证实了FGL1是LAG-3诱导细胞抑制功能和免疫逃避的主要配体。 研究人员通过微阵列数据库和蛋白质组分析，结果显示与正常组织相比，人类实体肿瘤（包括肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和结直肠癌）中的FGL1-mRNA上调率较高，其中肺癌数据集中上调率最高。之后，研究人员分析了非小细胞肺癌中FGL1蛋白的表达情况（图5），发现FGL1蛋白主要分布于肿瘤细胞中，肿瘤间质表达较低，在正常肺组织没有表达。NSCLC组织中FGL1的表达水平呈连续分布，约15%的样品有较高的表达量，同时高FGL1表达量与明显降低的5年生存率相关。此外，在另一组队列研究中，研究人员发现与健康人相比，NSCLC病人血浆FGL1水平明显偏高，同时在接受抗PD-1治疗后，血浆中FGL1较高的患者拥有更低的总体生存率（图5E），另外在使用抗PD-1单抗治疗的转移性黑色素瘤患者（n=21）的独立队列中也观察到类似的结果（图5F）。 研究人员还在MC38小鼠肿瘤模型中测试了抗FGL1和抗LAG-3在B7-H1-PD-1通路阻断中的作用，结果表明，单独使用三种抗FGL1单抗、抗LAG-3单抗或抗B7-H1单抗处理是可以延缓肿瘤生长和部分延长生存率（图5G），而与单抗治疗相比，抗FGL1或抗LAG-3单抗联合抗B7-H1单抗能显著提高生存率（图5G）和降低肿瘤负担（图5H）。以上结果表明，FGL1-LAG-3相互作用是独立于B7-H1-PD-1通路的另一条肿瘤免疫逃逸通路，阻断这条通路能和抗PD-1治疗起到协同作用。
参考文献： Wang et al. Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3, Cell (2019), https:///10.1016/j.cell.2018.11.010 |
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