如何避免免疫组化（IHC）

生物_医药_科研 2019-01-24

展开全文

免疫组化是常用的蛋白检测方法之一，是实验狗必备的技能之一。该实验可以真实的反应蛋白在组织或细胞中的定位，也可以比较不同条件下组织中蛋白相对表达量的变化。

免疫组化实验流程比较复杂，稍不注意就会导致结果的失败。下面给大家分享一些免疫组化实验需要注意的小细节。

细节一：组织切片样本制备

用于IHC染色的组织样本可以是冰冻切片，也可以是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片。

冰冻切片的优点包括是抗原结构和更快的处理时间，而缺点则是由于冷冻而造成组织形态学的丧失，以及需要冷藏。
FFPE组织易于处理，可在常温下长期保存，通常更适合于免疫组化，但缺点是蛋白质的交联往往需要抗原修复。

具体选择制备哪种切片通常要考虑样本处理能力、可用的冷藏设施、样本存档的需要以及抗体与抗原修复的兼容性等因素。

细节二：抗原修复的必要性

FFPE样品通常要求在IHC染色之前进行抗原修复，因为固定过程通常会导致抗原掩蔽。蛋白酶诱导的表位修复(PIER)涉及到用蛋白酶K、胰蛋白酶或胃蛋白酶等酶处理样本，但成功率相对较低，并可能损害组织形态。
热诱导表位修复(HIER)，通常用微波或水浴进行，更受欢迎，但对时间、温度、缓冲液和ph等条件高度敏感。
冰冻组织样本通常不需要抗原修复。

细节三：如何选择合适的一抗

一抗的灵敏性和特异性对产生高质量的IHC数据至关重要。
不要假设一种适用于冰冻组织的抗体同样也适用于FFPE样品，反之亦然。抗体制造商通常指定抗体的哪一种样本类型已被验证，通常提供推荐的染色方案和验证数据。
一抗宿主的选择取决于组织样本的种属。例如，小鼠组织样本，一抗通常建议选择小鼠以外的物种，以防止抗小鼠二抗识别组织内源性IgG而导致的背景染色。
也可以选择酶或荧光团的直接标记的一抗进行染色。
如果对IHC抗体选择有疑问，可以参考Human Protein Atlas网站，这是一个开放的平台，可以提供细胞、组织和器官中所有人类蛋白的详细图谱，可以指导选择合适IHC抗体及阴阳性对照组织或细胞。

细节四：优化每一步实验

抗体的选择是免疫组化染色最关键的部分，而优化抗体浓度、孵育参数、稀释剂的选择以及实验流程中的其他步骤不应被低估。
此外，固定剂的类型、抗原修复方法、封闭和洗涤步骤都需要优化。同时也需要考虑阻断任何内源性酶活性的需要。
还需要选择合适的检测方法，例如结合链霉亲和素- HRP来放大生物素标记抗体的信号。

科学家们希望从珍贵的样本中获得更多的数据，以期获得更多发现。所以除了IHC实验本身的优化外，科学家们还在不断探索更多新的技术，如将质谱法结合到染色方案中可以促进抗原定量；在组织切片上研究mRNA表达水平，将蛋白和核酸检测的数据结合在一起。Duolink技术实现在组织原位进行蛋白瞬时互作和微弱互作的检测等。

更多免疫组化实验优化方案和新技术结合应用，欢迎联系默克技术支持热线 4008891988转2号线。

实验难做很大程度上也是因为总找不到好的抗体，默克提供免疫组化实验“金标抗体”- HPA抗体，五大优势，祝您成为免疫组化实验小能人。