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真香预警！来自一名医科大的小可爱： 辛苦奋斗半月余，终于拿到组织切片了~ 抗体也刚好到货。IHC，走你！ 据师兄经验， 预实验选择1:400和1：800抗体稀释比； ..... 满怀期待的盯着屏幕 ？？？ 恰逢老板路过，若无其事的瞟了一眼， “你...这是用巧克力做的切片吧？” 小可爱：...... 一番思考，越想越生气！ 投诉！再也不用这家抗体了！ ▶▶▶▶▶ 作为专业抗体生产商， 我们自然不能让客户失望而归。 首先，根据客户反馈记录，锁定关键点：抗体稀释比； 其次，根据质检数据（官网上完全公开的哦），该抗体推荐稀释比为：1:6400-1:25600； 最后，控制变量单一，使用相同的病理组织切片，以1:6400（a）和1:25600（b）两个稀释比进行复检： 实验结果：稀释比1:25600时，边缘区正常着色，生发中心基本无着色，完美！ ...... 后续：小可爱带着足足可做10000张片子的50ul神仙抗体跑去跟师兄嘚瑟，仅余20ul。 当然，科学家之所以值得被人尊敬，正是源于他们对失败的无所畏惧，以及对真理的不懈追求，可以被打脸，但不会被打败！ 今天，趁着这春光大好，阳光明媚，结合真实的IHC实战案例，给大家分享一堂实验课：细节优化提升IHC实验质量。   细节优化提升实验质量  免疫组化（immunohistochemisty），简称IHC，是应用抗原与抗体特异性结合原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，对组织细胞内抗原进行定位、定性及相对定量研究的一种重要实验方法。 由于靶标蛋白结构、性质、表达丰度等条件影响，IHC实验条件没有统一标准，细节，是IHC成功的关键秘诀！优化以下六个关键细节，你距离一个完美IHC结果就不远啦！ 以CD31抗体（货号：66065-1-Ig）为例（CD31定位于细胞膜，可做内皮细胞标记），检测10%福尔马林溶液固定的肝癌组织石蜡切片： 图 a 固定不佳，抗原丢失，未见着色； 图 b 固定良好，背景干净，正常着色； 重点：组织固定的目的在于保存及保护组织和抗原。一方面赋予组织一定硬度，维持原本形态结构；另一方面防止靶标蛋白性状改变，保存抗原性；良好的组织固定是IHC实验成功的基础。 以CXCR7抗体（货号：51024-1-AP）为例（CXCR7定位于细胞膜和细胞质），检测4% PFA溶液固定的小鼠大脑组织石蜡切片： 图a-b 未进行修复操作，未见着色；
图c-d Tris-EDTA（pH9.0）热修复，正常着色； 组织样本经过固定后，蛋白质与甲醛发生交联，抗原决定簇有可能被封闭。采用抗原修复可以使被屏蔽的抗原决定簇重新暴露出来，同时又不会对抗原表位造成破坏。 重点：一般来说，经过固定的切片均需要进行修复，比如石蜡组织切片。通过抗原修复能增强抗原抗体识别，提高IHC实验阳性率。 以 KRT20抗体（货号：60183-1-Ig）为例（KRT20定位于细胞质，主要表达于胃肠道上皮、尿路上皮和Merkel细胞），检测10%福尔马林溶液固定的人膀胱癌石蜡切片：
图a-b 柠檬酸钠（pH6.0）热修复，未见着色，阴性；
图c-d Tris-EDTA（pH9.0）热修复，正常着色，阳性 常用抗原修复方法包括高压热修复、微波热修复、胰酶修复三种；其中热修复法又可采取Tris-EDTA（pH 9.0）和 柠檬酸钠（pH 6.0）两种修复缓冲液。 重点：根据多年实战经验，高压热修复简单易操作，效果优于其他两种方法；而对绝大部分抗体而言，其中碱性修复效果更佳。 以上面BCL2抗体（货号：60178-1-Ig）为例（BCL2定位于细胞质，正常表达于淋巴结套区B细胞、T区大部分细胞，滤泡中心细胞无表达），检测10%福尔马林溶液固定的人扁桃体炎组织石蜡切片：
图 a 抗体稀释比1:400，无法区分； 图 b 抗体稀释比1:25600，正常着色； 抗体稀释度作为免疫实验的关键条件之一，因蛋白而异，因抗体而异，蛋白表达丰度不同，抗体亲和力不同，均会对二者结合造成影响。 重点：抗体稀释度以产品说明为准，作为一名成熟的科研人员，你该学会自己看说明书啦！而作为一名成熟的抗体供应商，我们会把最佳稀释比写在说明书上。 以BCL6 抗体（货号：66340-1-Ig ）为例（BCL6定位于细胞核，可用于标记生发中心细胞），检测10%福尔马林溶液固定的人扁桃体炎切片：
图 a-b 未进行硫酸铜处理，着色较浅
图 c-d 1%硫酸铜溶液处理5分钟，着色加深 DAB氧化后能形成的棕黄色不溶物，这也是我们判断IHC阳性组织的依据，但如果染色时间很长(如超过十分钟)才出现阳性染色，我们可进行硫酸铜溶液处理。 重点：DAB氧化后形成的棕黄色不溶物能与铜离子络合，生成趋向棕黑色的产物，使得显色效果加强，阳性结果更加显著。 以KRT5抗体（货号：66727-1-Ig）为例（KRT5定位于细胞质，表达于鳞状上皮和导管上皮的基底细胞及部分鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞，而绝大多数腺上皮细胞几乎不表达），检测10%福尔马林溶液固定的人乳腺增生组织、人肺鳞癌组织、人肺腺癌组织石蜡切片：
图 a-b 人乳腺增生组织，肌上皮表达，正常着色
图 c-d 肺鳞癌组织，高表达，正常着色
图 e-f 肺腺癌组织，不表达，未见着色 重点：一组科学的实验，必须有实验组和对照组之分，而对照组又分为阴性对照和阳性对照；阳性对照（肺鳞癌组织）排除实验操作造成的假阴性结果；阴性对照（肺腺癌组织）排除不良试剂的假阳性结果；综合二者，我们才能获得真实客观的实验数据。 每一张切片，都是对真理的追求； 每一步操作，都是实验成功的关键； IHC的世界里，细节为王！ >_< 好啦~ 今天的重点就划到这儿啦~ 小可爱们，你们都记住了吗？ 更多实验细节，请查阅《Proteintech实验技术手册》！ 1. 您可以联系当地Proteintech授权代理商索取； 2. 您也可以在Proteintech网站（ptgcn.com）直接下载。 3. 您还可以微信留言，小编给您发送下载链接。 —— END —— |
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来自： Avivaeqt299d83 > 《免疫荧光》
