点击上面蓝字↑↑↑关注【解螺旋】 ——日读一帖,解螺旋大V团队伴你科研路 【科研热点】让你时间比别人花的少、知道的比他早! 【基金专栏】国自然等各项基金独到经验见解 【SCI 专栏】从开始到接收全程tips 【实验技能】这么棒快告诉你老板! 关注我们,为您的科研路提速
花花相信大家对IHC一定不陌生,世界那么大,实验方法层出不穷,但是免疫组化却是经典中的经典,想看看别的高大上的技术?不急,我们先来复习复习免疫组化。 免疫组化,免疫组织化学技术(immunohistochemistry),是一项利用抗原抗体反应,通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对蛋白定位,定性的实验技术。 免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理切片和组织芯片)和冰冻切片。石蜡切片,对组织形态保存好,保存时间也长,虽然对组织抗原暴露有影响,但可以抗原修复,所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。 好了,重点来了,下面是花花多年来总结的免疫组化步骤和经验,各位看官不要错过哦!
结果分析: 镜下细胞核呈蓝色,阳性结果呈深浅不一的棕色 比如这样: 结果分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下,随机10个视野下计数阳性着色细胞;后者则是在光学显微镜下按染色程度(0分阴性着色,1分淡黄色,2分浅褐色,3分深褐色)和阳性范围(1分0-25%,2分26-50%,3分51-75%,4分76-100%)评分,最终分数相加。
再来看下反面教材 最常见的非特异性着色: 还有背景过深的: 要避免成为上述的两种典型,做出一张可以见老板的结果,每步都要且做且思考。花花再啰嗦几句: 1 脱蜡和脱水的步骤呢,每个实验室都有自己独到的方法,用的乙醇的梯度不完全相同,大家按照自己的习惯那套来就好。但要注意,脱蜡和水化不全引起局灶性反应,会导致非特异性着色。 2 一定要防止干片!干片也很容易引起非特异性着色。 3 在用枪头抹平抗体时,要尽量将枪头放平,用斜面而不要用尖头接触组织,这一步要轻柔小心,可能你只是轻轻刮到几下,但镜下组织就变得乱七八糟的了(别问我是怎么知道的) 4 PBS在洗的时候,不要对着组织冲洗,会脱片。小编的方法是将冲洗着力点放在玻片的边缘,让液体自然流向组织。 5 一抗浓度至关重要,这直接影响了最终的结果,摸条件时设置一抗浓度梯度。建议同时设置一个阳性对照,可以排除一抗之外的操作问题。 6 背景染色过深的话,就要考虑一抗浓度过高或者一抗时间过长,显色时间过长这些问题了。 7 降低组织非特异性染色,可以缩短一抗,二抗的时间,稀释抗体,也可以增加几次PBS冲洗。或者直接用单抗。 免疫组化往往作为检测某蛋白在组织的表达情况出现在预实验中,免疫组化的结果可能将直接影响课题的后续设计和进展。如果说我们的科研课题是一个大世界的话,免疫组化是我们看向这个世界的敲门砖。 做好免疫组化 我们一起去更大的世界看看
|
|