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责编丨迦 溆 赖氨酸的甲基化修饰是蛋白翻译后修饰的一个总要组成部分，同时作为表观遗传的重要标识（mark），组蛋白的甲基化修饰在基因转录调控方面起着决定性的作用，比如H3K9和H3K27的三甲基化修饰预示着基因转录抑制，而H3K4的二、三甲基化修饰预示着基因转录激活。最近研究证实组蛋白甲基化的修饰是胚胎发育的重要调控因素【1】 。病理学上，由于组蛋白甲基化异常导致癌基因表达或抑癌基因抑制，从而可以诱发多种肿瘤。因此甲基化酶的抑制剂，包括EZH2， DOLT1的小分子抑制剂已经进入血液肿瘤的临床治疗中【2,3】。然而，最近不断有新的非组蛋白底物可以被组蛋白甲基化酶所识别和甲基化，从而影响这些蛋白的降解、活性、与其他蛋白的结合或者细胞内定位的改变，进而影响肿瘤细胞的增殖、转移或者抗凋亡的能力【4】。因此发现更多的在肿瘤发生、发展中起到重要作用的非组蛋白的甲基化修饰底物，是针对性开发甲基化酶分子抑制剂和进一步进行个体化治疗的一个重要方向。 1月28日，最新一期Nature Cell Biology杂志以“背靠背”的形式在线了分别来自哈佛医学院贝斯医学中心的魏文毅教授课题组（第一作者为目前在中山大学一附院的郭剑平博士，论文第一单位为中山大学一附院）和Wake Forest大学的林慧宽教授课题组（第一作者为目前在华中科技大学同济医学院的Guihua Wang博士，论文第一单位为同济医学院）关于组蛋白甲基化酶SETDB1通过甲基化AKT，来激活AKT的激酶活性从而促进肿瘤发生的新发现。 魏文毅教授课题组题为AKT methylation by SETDB1 promotes AKT kinase activity and oncogenic functions的论文中，研究人员通过利用通用的三甲基化赖氨酸（k-me3）抗体来富集非组蛋白的甲基化修饰蛋白，联合高分辨率串联质谱的检测与分析方法（下图），发现了近千个赖氨酸甲基化位点，及对应的近百个新的可以被甲基化的蛋白。其中，他们发现了位于AKT1的linker区域（K140/K142）的赖氨酸三甲基化片段。 PI3K/AKT信号通路是被研究最多的一条促进肿瘤发生、肿瘤耐药和代谢改变的通路。生理条件（比如生长因子刺激、缺氧等）或病理条件（比如癌基因EGFR, RAS, PIK3CA突变或抑癌基因PTEN失活）的改变都可以显著的增强AKT的激酶活性。而活化的AKT通过磷酸化大量的底物（具有时间和空间的特异性）来调控细胞对这些改变的适应。而AKT的过激活是肿瘤、肥胖、糖尿病等疾病发生的重要因素之一【5】。Wenyi Wei教授题组对AKT信号通路有过深入的研究，他们曾发现细胞周期蛋白CDK2可以直接磷酸化AKT尾端丝氨酸，从而以一种细胞周期依赖的方式激活AKT激酶 （Nature, 2014）；之后他们发现，在缺氧环境下，AKT不能被缺氧诱导因子（HIF）的羟基化酶EglN1进行羟基化修饰，从而不能被抑癌基因VHL识别，以阻止去磷酸化酶PP2A的抑制作用，从而阐明了AKT在实体瘤缺氧环境下或VHL突变的肾癌中激活的机制（Science, 2016）。 在确定AKT1上具有甲基化修饰后，研究人员对AKT1的甲基化修饰进行了验证和功能研究。首先，他们通过一系列体内和体外实验证实了AKT1确实可以被三甲基化，而通过构建甲基化缺失的AKT1突变体，可以显著降低AKT1的激酶活性，从而极大的抑制了AKT对生长信号的反应，在功能上抑制了肿瘤细胞的增殖、克隆形成及葡萄糖摄取、乳酸生成现象，最终影响了肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力。为了进一步研究甲基化修饰对AKT体内功能的影响，通过CRISPR/CAS9技术，他们构建了甲基化缺陷的Akt1转基因小鼠，该小鼠表现出了体重减轻、脏器（肝脏、脾脏、肾脏）体积减小等Akt1敲除小鼠的性状，通过化学诱导的方法，他们进一步发现AKT1的甲基化缺失可以抵制化学诱导的方法生成的皮肤肿瘤的数量和大小，从而揭示了甲基化缺失对AKT1激酶活性的抑制作用 （下图）。 通过分析一系列的甲基化酶和文献检索，他们利用多种方法证实了组氨酸甲基化酶SETDB1可以直接结合并甲基化AKT1。通过生物信息分析，他们发现SETDB1的基因扩增与PI3K/AKT通路的异常激活是相互排斥发生的（mutually exclusive），之后证实了SETDB1可以通过甲基化来激活AKT1信号通路。尽管以前报导SETDB1具有癌基因的功能促进黑色素瘤的发生【6】，这里他们证实了敲除AKT1，或者敲入甲基化缺失的AKT1可以显著的抑制SETDB1的促肿瘤发生的能力，即SETDB1的癌基因功能主要是通过甲基化并激活AKT来实现的。
因为PI3K/PDK1是已知的、最重要的调控AKT-pT308和激酶活性的通路，因此他们进一步研究了SETDB1诱导的AKT甲基化和PI3K/PDK1诱导的AKT磷酸化之间的关系。在截短结合实验中，AKT的PH结构域被发现可以直接与SETDB1结合；在细胞实验中，PI3K的抑制剂可以抑制，而AKT1-E17K突变体可以促进AKT1与SETDB1的结合，因此他们推测PIP3诱导的AKT开放性结构可以促进AKT的PH结构域与SETDB1结合。为此，他们进行了体外结合实验，验证了这一假设，最终提出了PIP3打开AKT的锁状结构，促进PH结构域与SETDB1结合，而结合的SETDB1可以甲基化暴露的AKT1-linker区域。在linker区域发生的三甲基化修饰可以引起AKT蛋白位相结构的改变，促进PDK1的结合和AKT磷酸化的发生，最终AKT被激活 （下图）。 在研究AKT甲基化的同时，魏文毅教授课题组也对AKT的去甲基化酶进行了鉴定和分析，他们发现KDM4家族中，KDM4B（JMJD2）可以结合并减少AKT1在K140/K142位点的甲基化修饰。同时KDM4B敲低的细胞系，具有更高的AKT激酶活性和对生长激素刺激的反应。而敲低SETDB1可以显著的抑制KDM4B与AKT的结合，这些发现证实了KDM4B可能是拮抗SETDB1介导的AKT甲基化的去甲基化酶。
在结论的最后，魏文毅教授课题组探讨了针对SETDB1的抑制对肿瘤治疗的潜在可能性。他们发现敲低SETDB1可以显著的抑制黑色素瘤在小鼠中的成瘤能力，同时伴随着AKT激酶活性的降低。由于缺乏特异性的SETDB1甲基化酶抑制剂，他们替代的使用了一种抗生素mithramycin A，这种抗生素被证实可以显著的在转录水平上抑制SETDB1的表达。mithramycin A的处理可以显著降低SETDB1蛋白表达和AKT激酶活性，同时抑制黑色素瘤细胞系在小鼠中的成瘤能力。他们同时指出了开发SETDB1特异的小分子抑制剂通过抑制AKT的激酶活性和激活H3K9me3介导的基因抑制对拮抗SETDB1扩增或激活的肿瘤具有显著的潜在临床效应(下图)。 在文章的讨论部分，他们提出了在后期的质谱验证过程中，也发现了其他的AKT1赖氨酸可以被甲基化，包括位于PH结构域的K64位点。并且该位点的甲基化改变可以影响他们发现的K140/142的甲基化和AKT的磷酸化，同时K140/K142的甲基化也可以影响K64的甲基化。 本文前面提到了，还有另一项来自林慧宽教授课题组题为SETDB1-mediated methylation of Akt promotes its K63-linked ubiquitination and activation leading to tumorigenesis的研究成果同样证实了SETDB1介导的AKT甲基化对肿瘤发生的重要作用。在这项研究中，研究人员发现和验证了AKT1的甲基化发生在K64，证实了该点的甲基化可以促进AKT与TRAF6结合，引起AKT的K63泛素化，从而促进AKT的膜定位和进一步激活【7】。这个工作是Huikuan Lin教授课题组2009年Science文章中揭示TRAF6激活AKT1膜定位和激酶活性的完美延伸【7】。Wenyi Wei教授课题组中也揭示了K140/142甲基化可以显著的影响AKT/TRAF6的结合及AKT泛素化的发生，所以他们推测K140/K142先于K64被甲基化，而K140/K142的甲基化进一步加强AKT/SETDB1的结合，从而引起更多的赖氨酸 （包括K64）被甲基化，这些甲基化修饰一起通过促进ATK与PDK1结合或者促进AKT的膜定位调控AKT的激酶活性。因此，SETDB1介导的AKT甲基化是一个多位点的、复杂的、相互影响的过程，与TRAF6介导的AKT的泛素化、PDK1介导的AKT的磷酸化一起调控AKT的激酶活性。 总的来说，Wenyi Wei教授和Huikuan Lin教授课题组的共同发现不仅进一步揭示了AKT新的翻译后修饰和更精细的调控方式，还指出了组蛋白甲基化酶SETDB1作为一个潜在的靶向位点，用于肿瘤治疗的重要临床意义。 图为两篇论文的通讯作者：魏文毅（左）和林慧宽（右） 专家点评 高大明（中科院生化与细胞研究所研究员） 磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B通路（PI3K-AKT pathway）是细胞响应胰岛素、生长激素等胞外信号，调控细胞代谢、增殖及生存的关键信号转导通路之一。近二十年来的研究表明，临床实践中多见的PI3K-AKT通路活化对于肿瘤细胞的生存及增殖至关重要，并驱动了肿瘤耐药及快速进展等恶性表型的发生。一般认为PI3K激酶的活化首先在质膜上生成三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），而AKT通过其氮端PH结构域与PIP3的结合定位到细胞质膜上，从而在Thr308与Ser473两个位点分别被PDK1与mTORC2激酶（复合体）所磷酸化并激活，活化的AKT激酶进一步通过磷酸化特定底物分子调控各种细胞生理过程。 AKT是如何定位到细胞质膜上的？有哪些未知调控机制在其活化过程中发挥作用？这些一直是本领域悬而未决的问题。在近日发表的两项研究中，美国哈佛大学医学院的魏文毅教授与美国维克森林大学的林慧宽教授同时发现AKT 氮端PH结构域K64、K140、K142三个赖氨酸残基的甲基化对于AKT的活化非常重要，这些位点的突变或甲基转移酶SETDB1的敲降会导致AKT Thr308/Ser473磷酸化的显著降低，及肿瘤细胞增殖代谢下调等一系列表型。特别是魏文毅教授研究组通过制备甲基化位点突变的转基因小鼠模型，充分证明了这些甲基化修饰对于AKT驱动肿瘤发生的重要性，并通过细胞及动物实验提示光辉霉素（mithramycin A）可能是抑制SETDB1-AKT通路的有效抗肿瘤药物。因此，这两项杰出的研究通过精巧的实验设计、丰富扎实的的生化/细胞/动物模型实验数据、严密的逻辑推导，首次揭示了AKT激酶受到甲基化修饰的重要现象并深入解析了其功能及调控机制。这些工作为我们进一步理解PI3K-AKT通路活化的分子机理，及针对性开发抗肿瘤策略提供了新的理论基础。 参考文献： 1. Li, E. Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nat Rev Genet 3, 662-673 (2002). 2. Kelly, T.K., De Carvalho, D.D. & Jones, P.A. Epigenetic modifications as therapeutic targets. Nat Biotechnol 28, 1069-1078 (2010). 3. Daigle, S.R. et al. Potent inhibition of DOT1L as treatment of MLL-fusion leukemia. Blood 122, 1017-1025 (2013). 4. Huang, J. & Berger, S.L. The emerging field of dynamic lysine methylation of non-histone proteins. Curr Opin Genet Dev 18, 152-158 (2008). 5. Manning, B.D. & Toker, A. AKT/PKB Signaling: Navigating the Network. Cell 169, 381-405 (2017). 6. Ceol, C.J. et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature 471, 513-517 (2011). 7. Yang, W.L. et al. The E3 ligase TRAF6 regulates Akt ubiquitination and activation. Science 325, 1134-1138 (2009). |
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