|
激酶介导的磷酸化调控是细胞内传递信号的主要方式，因此各种疾病在发生过程中都有激酶参与。而激酶相比其他蛋白，相对容易筛选抑制剂，因此激酶是很好的疾病候选药物靶点。激酶参与疾病，可以是激酶表达量在疾病中发生改变，导致下游信号改变；也可以是激酶活性发生改变，导致下游信号改变，今天给大家分享的文章就属于这一类。激酶活性受甲基化调控，参与肿瘤。（激酶参与疾病，还有其他方式，比如激酶量没有改变，活性也没有改变，底物改变也可以导致下游信号改变；也可以是底物也没有改变，但是有个adaptor，可以是蛋白也可以是lnc，把激酶跟底物拉在一起，导致下游信号改变。）我们先看看两篇今年发表在Nature cell biology的文章：1. SETDB1-mediated methylation of Akt promotes its K63-linked ubiquitination and activation leading to tumorigenesis. 2019.2. AKT methylation by SETDB1 promotes AKT kinase activity and oncogenic functions. 2019.两篇文章都是研究AKT受SETDB1甲基化修饰，活性发生改变，促进肿瘤。我们这次选择第一篇来跟大家做个分享，参考学习其研究思路，分享按照Results的顺序来。 一、SETDB1 interacts with Akt and is required for Akt activation 1. 本研究一开始的目的是找到磷酸AKT的调控物，或许是激酶，或许是adaptor。构建了HA-AKT1，到工具细胞293T中进行IP，把IP下来的蛋白打质谱鉴定。我们在找A蛋白互作蛋白时，也可以采用这种方法。但是，建议是到目标细胞中进行IP，有时还需要把目标细胞进行刺激激活。比如找SMAD的互作蛋白，SMAD传递的是TGFb的信号，这时，细胞就需要用TGFb来刺激激活。如果到293T细胞上做IP，十有八九找不到想要的蛋白。2. IP鉴定的结果中发现有SETDB1这个甲基转移酶。用CO-IP也验证了SETDB1与AKT的互作。3. 采用in vitro binding实验验证了两者是直接互作。这里就是评估SETDB1是否为adaptor。4. 采用体外磷酸化实验发现AKT不能磷酸化SETDB1。跟AKT直接互作，很容易想到可能是底物，这里评估发现不是底物。这就有意思了。5. 在IGF-1的刺激下，AKT和SETDB1的互作增强。（前面IP-MS的实验，其实保险的做法是在IGF-1的刺激下进行）。这里说明，SETDB1与AKT互作，可能是传递信号，很有意义。（我们在研究中，也需要这样一步一步踏实地进行验证推进。）6. 对SETDB1进行干预，观察AKT的变化，发现SETDB1可以促进AKT T308的磷酸化（在IGF-1的刺激条件下）。（这里如果借鉴要注意，两个蛋白互作可能存在的功能是什么？不一定是磷酸化改变，文中展示的是阳性结果。 二、SETDB1 triggers Akt K64 methylation to mediate Akt phosphorylation 1. SETDB1是甲基化转移酶，与AKT互作，那么AKT是否是其甲基化底物呢？发现在IGF-1和EGF因子的刺激下，AKT发生了三甲基化（tri-methylation）。2. 体外甲基化实验显示，SETDB1可以甲基化AKT，且SETDB1酶活突变体H1224K，不能甲基化AKT。3. 接着寻找AKT受甲基化的位点。通过质谱并进行验证，发现AKT K64位点是受SETDB1甲基化的位点。 三、Akt K64 methylation is critical for Akt activation and cell membrane localization 1. 有了位点，一般研究中就要看看位点功能了。因此把K64突变，发现改位点突变可以影响下游的信号（以下游AKT的磷酸化底物FOXO3A的磷酸化为指标），同时也影响AKT T308的磷酸化激活。2. 干预SETDB1，可以影响AKT在膜上的定位。 四、SETDB1-mediated Akt K64 methylation promotes tumorigenesis 1.SETDB1对AKT进行甲基化，是否有临床意义呢？采用肺癌细胞A549进行实验发现，干扰SETDB1后，AKT的甲基化下降，T308磷酸化下降，细胞克隆形成能力降低。2.裸鼠成瘤模型中，SETDB1干扰后，瘤体减小，成瘤率下降。3、采用NIH3T3细胞进行成瘤转化实验，也获得SETDB1可以甲基化AKT促细胞癌变。五、SETDB1-mediated Akt K64 methylation correlates with Akt activation and predicts poor survival of NSCLC patients 1. 临床意义最终是要到临床样本上来验证，发现SETDB1在肿瘤中高表达。（采用的是公开数据库进行的验证）2. 采用KM-PLOT数据库发现高表达SETDB1的非小细胞肺癌患者预后差。3. 以上是数据库的信息，研究者也采用了自己收集的样品进行了验证，发现SETDB1确实在肺癌中高表达。（采用公开数据库后，最好能够有自己收集的样品进行验证，不需要多）4. 在111例NSCLC样品中，把AKT K64的甲基化与预后进行了分析，发现与预后相关。做到这步不容易。作者能够做到，除了有带回访信息的临床样品外，还有很好的AKT K64位甲基化的抗体（自己制备）。 六、Akt K64 methylation is essential for Akt-E3 ligase interaction and Akt K63-linked ubiquitination 1. 继续进行探讨，属于机制内容，探讨AKT K63甲基化后为什么可以促进其膜定位？发现可能与PDK1的互作相关。2. 验证发现，AKT K63位的甲基化对于K63的泛素化是必须的。K63甲基化可以介导AKT与其E3泛素酶TRAF6、SKP2的互作。 七、JMJD2A is important for recognizing K64 methylated Akt and facilities the Akt-E3 ligase interaction 1. 由于TRAF6和SKP2没有可以识别甲基化的domain，考虑是否有adaptor。采用K64甲基化的AKT和K64R突变体进行IP-MS，找到了300个蛋白与K64甲基化互作，但跟K64R不互作。TRAF6和SKP2在这300个蛋白中。2. 300个蛋白中，找到JMJD2A（如何定位到这个蛋白？组学大家都会做，但从组学数据中如何确定自己想要的蛋白，看每个人的技术与能力，实在不行可以找专家帮忙。）CO-IP验证了JMJD2A与AKT、TRAF6、SKP2存在互作，且互作依赖SETDB1对AKT K64位的甲基化。 八、JMJD2A non-demethylase function contributes to Akt ubiquitination and activation JMJD2A是个去甲基化酶。那么其酶活是否参与此处的功能呢？发现其介导AKT互作、磷酸化泛素化激活，不需要其酶活，用了其酶活突变体H188A。这里提示我们，如果我们做的课题中出现了酶，那么探讨酶活是否参考功能是论述严谨的地方。这篇文章在分子关系的验证上做得很严谨，值得大家借鉴：1. 找A蛋白的互作蛋白B，这两者如果有一个是酶，这样的课题优先做。比如A为酶，那么就探讨B是A的底物还是A酶活的调控物？还是A与底物的adaptor？本文中，SETDB1是酶，AKT为底物，JMJD2A为adaptor。（不过要注意，JMJD2A作为adaptor不是介导AKT与SETDB1，而是甲基化的AKT与其泛素化酶。）2. 酶活是否参与功能？做酶活突变体。SETDB1的H1224K、JMJD2A的H188A，一个需要酶活，一个不需要酶活。4. 底物修饰位点是否参与功能？AKT的K64R突变进行实验。（这里注意，如果是做磷酸化，这里位点可以做激活突变体和失活突变体，论证可以更严谨。）5. 功能回复实验。文章中证明突变体功能时，不少是用功能回复实验来证明的。SETDB1对AKT K64进行甲基化后，可促进AKT T308位点磷酸化及K64泛素化，两个下游方向。本文后面重点探讨了K64泛素化，找到了泛素化酶及adaptor。AKT T308位点磷酸化是其激活需要的，文中已证明。但其磷酸化修饰的激酶是谁？文章给出了一个AKT互作的激酶PDK1，但没有进一步探讨PDK1是否为T308磷酸化的激酶（难道在其他研究中已经证明了吗？大家可以去查查看）。K64的甲基化会影响T308的磷酸化，那么可以到前面K64甲基化与K64R IP-MS的数据中找，也就是那300个蛋白中看看，是否有激酶？如果有，可以用来验证。如果没有，看看这300个蛋白，有哪些可能是激酶的adaptor？如果找到，创新性好，如果临床意义也大，加上论证严谨，便可以找找合适的10分以上杂志发表。
|
