 前言 利用基因组测序（全基因组重测序、简化基因组测序）或基因芯片技术可获得大量的SNP标记，那么接下来大家都会考虑一个问题：我们该如何去验证和使用它们呢？针对不同实验目的，小编给出以下建议。 情境一 由公司完成SNP分型并执行相关分析要求（如群体遗传分析）之后，如果我们后续的研究不再需要SNP标记进行辅助，仅单纯想验证一下SNP分型结果的准确性。那么小编推荐使用Sanger测序法、Taqman探针法、Sequenom、SNaPshot等技术，可一次对十几个或几十个SNP位点进行验证，并能对分型结果的可靠性作出较准确的评估。 情境二 如果我们后续的研究中仍需要使用SNP标记进行辅助，如品种特异分子标记开发、图位克隆、分子标记辅助育种（MAS）等。那么小编建议在验证SNP分型准确性的同时，可将其转化成以PCR为基础的分子标记，以方便各位在自己实验室开展后续工作。此类型的方法主要有CAPS、dCAPS、AS-PCR三种，讲到这，本专题的3位主角终于登场。鉴于前两位的技术原理类似，故将它们一起作为本专题的第一发与大家见面。 （满满的干货奉上 ~） CAPS标记 1.全称 CleavedAmplified Polymorphism Sequences（CAPS）——酶切扩增多态性序列 2.原理简介 若SNP刚好处于某一限制性内切酶的识别位点上，则可通过PCR技术与RFLP技术的结合，将SNP转化为CAPS标记。基本步骤是在SNP位点的两侧设计引物，PCR特异性扩增，使用相应识别位点的限制性内切酶对PCR产物进行酶切后电泳检其多态性。CAPS为共显性分子标记，可判断纯杂合。（讲到这里大家可能还有较多疑惑，接着往下看） 3.实例解析 以拟南芥研究中经常会使用的两种生态型材料Col与Ler为例，经高通量测序发现两生态型材料在基因组某处存在纯合差异的SNP位点（灰色背景位置），观察发现在Col材料中该SNP位点刚好位于EcoRI的酶切识别位点上（红色字体，5’-G▼AATTC-3’），而Ler材料中该位点为G碱基，不存在EcoRI识别位点。 Col-seq：(AA) 5’···NNNNNNGAATTCNNNNNN···3’ 3’···NNNNNNCTTAAGNNNNNN···5’（该位点纯合，只存在这一种DNA双链） Ler-seq：(GG) 5’···NNNNNNGAGTTCNNNNNN···3’ 3’···NNNNNNCTCAAGNNNNNN···5’（该位点纯合，只存在这一种DNA双链） 此时，可在该SNP位点两侧设计引物，在两种材料中分别扩增包含该SNP位点的片段，如下图所示，PCR产物长度为600bp，SNP位点左侧400bp，右侧200bp。使用EcoRI酶对两种PCR产物分别进行酶切及电泳检测，结果见下图。纯合的Col中，由于EcoRI酶切位点的存在，PCR产物会被切为两条带（200bp、400bp）；纯合的Ler中，不存在该酶切位点，内切酶无法发挥作用，只有一条带（600bp）。对于两生态型的杂交后代而言，会同时存在上图的两种DNA双链，是杂合体，在该位点处的分型结果为AG，同样进行如上检测后电泳会出现三条带（200bp、400bp、600bp）。因此，CAPS标记既可用于品种鉴定，也可用于判断纯杂合，且使用实验室常规仪器及方法即可操作，是一种非常方便实用的共显性分子标记。 CAPS标记原理图（Lukowitz et al.，2000） Std：DNA marker；Col：homozygous Col；Ler：homozygous Ler；Het：heterozygote
dCAPS标记 1.全称 derived CAPS（dCAPS）——衍生的酶切扩增多态性序列 2.原理简介 SNP恰好位于限制性酶切识别位点上的情况比较少，当SNP不位于限制性内切酶识别位点时，可以在CAPS标记的基础上，以SNP位点左侧约20bp的序列作为正向引物，在其中引入1~2个错配碱基，再结合SNP位点的特定碱基，人为改造出可用的限制性内切酶识别位点，产生和CAPS标记类似的多态性，这就是dCAPS的基本方法。（为加深各位看客的理解，我们同样举例说明，接着往下瞅） 3.实例解析 仍以拟南芥Col与Ler两种材料为例，测序发现基因组某处存在纯合差异的SNP位点（灰色背景位置），观察发现若把该SNP位点左侧第8个碱基G更换为C，则在Ler材料中就出现了BslI酶切识别位点（5’-CCNNNNN▼NNGG-3’）。后面需要做的事情就可以参考CAPS标记的流程了，唯一不同的是dCAPS需要在正向引物中引入错配碱基，人为改造内切酶识别位点。 Col-seq：(AA) 5’···CGNNNNNNNAG···3’ 3’···GCNNNNNNNTC···5’（该位点纯合，只存在这一种DNA双链） Ler-seq：(GG) 5’···CGNNNNNNNGG···3’ 3’···GCNNNNNNNCC···5’（该位点纯合，只存在这一种DNA双链） 如下图所示，经PCR扩增后，两样品中SNP位点左侧的第8个碱基均出现了C碱基。这意味着纯合Ler样品的扩增产物可被酶切，产生两条带（一条约160bp，一条约20bp，注意示例图中未显示20bp条带）；纯合Col样品中则只有一条180bp未经酶切的条带；而杂合体中则应出现三条带（未显示20bp条带）。因此，dCAPS标记同样为共显性标记。 dCAPS标记原理图（Lukowitz et al.，2000） Std：DNA marker；Col：homozygous Col；Ler：homozygous Ler；Het：heterozygote |
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