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什么是染色质免疫共沉淀技术（ChIP）？ 染色质免疫共沉淀法是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。这项技术主要用来分析目标基因有没有活性、或者分析一种已知蛋白(转录因子)的靶基因有哪些。真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。 CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。 一、CHIP常见用途 1、DNA甲基化 脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点,即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%-90%的CpG位点已被甲基化,但是在某些特定区域,如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。1%-2%的人类基因组是CpG群,并且CpG甲基化与转录活性成反比。 2、蛋白质甲基化 蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次(称为一甲基精氨酸)或两次(精氨酸甲基转移酶(PRMTs)将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同—个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸,或者在每个氨端各加—个甲基成为对称性二甲基精氨酸)赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一次、两次或三次。在组蛋白中,蛋白质甲基化昰被研究最多的一类。在组蛋白转移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因表达,从而形成为表观遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形式。 3、组蛋白修饰 在保持组蛋白和DNA联合的同时,染色质被切成很小的片断,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,将目标片段(发生组蛋白特异标记的片段)沉淀下来。此外H4—K20的甲基化与基因沉默相关,H3—K36和H3—K79的甲基化与基因激活有关。但应当注意的是,甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。 4、DNA甲基化 活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 组蛋白修饰包括组蛋白甲基化和乙酰化，都用 ChIP assay那是如何知道我是想检测甲基化水平还是乙酰化水平？ 抗体→甲基化转移酶/乙酰化酶特异性抗体. 二、CHIP原理 利用抗体专一性特征，检测蛋白质-蛋白质相互作用。 1、染色质免疫共沉淀 研究蛋白质与核酸相互结合的技术。 甲醛固定时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。 细胞内，能够相互结合的蛋白与基因靠的比较近，或者契合在一起。此时甲醛处理能使它们之间产生共价键而绑定在一起。 2、染色质结构 染色质由紧密聚集的组蛋白和DNA，以及结合在DNA上的其他物质组成。 3、染色质免疫共沉淀 利用甲醛交联蛋白与核酸，使蛋白质抗体沉淀蛋白-核酸复合物后，检测蛋白质上的核酸。 三、CHIP 示例 1、 CHIP-qPCR 研究 VCaP细胞在有或无E2处理时 ERα 聚集到 NEAT1 启动子区。 IgG或ERα抗体沉淀下复合物后，针对猜测的DNA序列设计引物检测是否有特定的DNA序列与Erα结合。适用于想要研究某个特定蛋白是否结合自己猜测的基因。需要针对基因不同区段设计引物。 2、 CHIP-seq 研究 SW480细胞内转录因子P53结合的mRNA、蛋白质、基因。 细胞经处理后进行CHIP，利用P53抗体沉淀复合物，然后分离纯化复合物内核酸进行高通量测序。适用于想要研究某个特定蛋白，但是不知道结合的基因有哪些。 3、 CHIP-qPCR 研究细胞在转染sh-RNA或对照后，分别采用RA处理后H3K56Ac结合的lncRNA和基因细胞经处理后进行CHIP，利用H3K56Ac抗体沉淀复合物，然后分离纯化复合物内核酸，使用预测的引物检测lncRNA或基因富集。适用于研究或验证与lncRNA结合的蛋白。 文末福利 【染色质免疫共沉淀实验原理及操作视频(CHIP)】 关注底部公众号【ZSCI】 回复关键词“chip”即可领取！ |
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