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小编听说很多公司已经放假了， 就连平日里打招呼的快递小哥，都已经回家过年了。 不知道现在的您，是不是正在回家的路上呢？ 不管是不是，今天小编就来安利一篇关于单细胞测序的佳作。 Title: Evaluation of variability in human kidney organoids Published: 20 December 2018 Journal: Nature Methods 从患者体细胞中提取诱导多能干细胞(iPSCs)，加上定向分化方案，为疾病影响的细胞类型建模提供了一种支持。这被证明对心肌细胞和神经元中疾病基因的验证以及分析它们对细胞功能的影响是有效的。类器官的复杂性增加了个体实验之间发生实质性变化的可能性。即使是患者和同基因对照的比较也受到细胞系之间变异的影响，事实上，类器官分化也往往涉及到数周的分化，在这期间，整体的变异都可能增加。 在这项研究中，我们提供了一个全面的肾脏器官方案的转录和形态学评估。我们将RNA测序(RNA-seq)应用于57个完整的类器官和8323个类器官来源的单细胞，检测了单个分化实验中类器官之间、不同分化实验(批次)之间、iPSC克隆之间以及从肾脏类器官分离的上皮细胞间的差异。我们的数据确定了一组高度可变的基因，这些基因反映了器官样体成熟、肾元分割和非靶向群体的差异，在各品系之间的差异不大于实验批次之间的差异。我们展示了如何利用该基因集的知识来改进疾病模型分析。 我们发现，即使在健康的类器官之间，由于类器官成熟速度的差异，也存在显著的批间差异。在疾病模型研究中，重要的是考虑批量变化，这可以混淆患者和对照类器官之间的差异，降低识别疾病机制的能力。仔细的实验设计，例如行与行之间的并行差异，可以减轻批与批之间差异的影响。 我们想要了解在重复分化实验时可能出现的转录变异水平。利用同样的iPSC细胞系，我们又进行了6次类器官分化实验，并在第18天从单个类器官中收集RNA。将第18天同一批次的类器官紧密地聚集在多维尺度图(MDS)上，同时分化的类器官间相关性最高。在所有基因中，对转录变异影响最大的是批次，瓶跟瓶的差异只是一个很小的因素。
图1：实验内部和实验之间转录变异的来源 我们检测了不同批次间差异化最大的基因，以了解转录变异是如何在第18天发生的。许多高变异基因与肾元成熟有关，在第18天类器官间最易变的50个基因中， 第7和16基因的模式分别与cluster10和cluster12一致，提示变异可能是由于肾元成熟度的差异所致。第18天的500个变异基因在肾素相关基因中高度富集，约80%的变异基因在第10天至第25天显著上调。利用这段时间内线性关联最大的10个基因，构建了7-25天时间序列数据的多元线性回归，这个框架能够估计相对于时间序列数据的第18天类器官的标准化“年龄”。 图2 批次间相对类器官成熟的预测 类器官成熟在转录变异中起重要作用。这种变异可能是在任何给定的器官中，由组成细胞类型内的表达变化或组成细胞类型的不同比例引起的，包括靶内(肾)和靶外(非肾)群体，此外，表达的变化可能是由于不同器官之间肾元分割的差异。在第25天从4个crl1502 - c32来源的肾脏类器官中分离出单个细胞。并对一个分化得到的三个类器官和另一个不同分化的类器官进行RNA测序。在筛选低表达的低质量细胞和基因后，对这些器官中剩余的8323个细胞进行聚类，生成13个聚类。虽然大多数细胞簇的细胞都存在于所有的类器官中，但它们的相对比例不同，最明显的是在不同批次之间，单细胞分析再次表明，来自同一批次的类器官是最相似的。 图3 单细胞分析显示在4个第25天类器官中细胞类型存在异质性
为了检测iPSC细胞系之间的差异，我们从一个健康的女性iPSC(RG_0019.0149.C6)中产生了肾脏类器官。RNAseq分别在3个独立但同时进行的分化实验的6个第18天类器官中进行，这两种细胞系产生的类器官具有明显的一致性，通过分化时间而非细胞系表现出更强的相关性和聚类性。 图4 iPSC细胞系之间的转录变异以及总器官样细胞和富肾上皮细胞之间的时间一致性 
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