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动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是导致冠状动脉疾病发病和患者死亡的主要原因，迄今仍未阐明其确切的病因及发病机制[1]。其主要治疗药物是调脂、抗凝及溶栓药物，治疗效果也不够理想[2]。中医无“动脉粥样硬化”的病名，但可归为“胸痹” 1 材料与方法 1.1 数据库 1.2 方法 1.2.1 化学成分和疾病的候选靶点预测 在TCM-IP平台中药材数据库中对心可舒片组方中药丹参、葛根、三七、山楂和木香进行化学成分信息收集，包括CAS号、中文名称、英文名称、分子式、相对分子质量、药理作用，并建立心可舒片的化学成分信息数据库。利用TCM-IP平台开源软件OpenBabel提取心可舒片化学成分MACCS分子指纹，通过化学成分二维结构（.mol）与FDA上市药物进行化学指纹特征比对，以Tanimoto系数定义的相似度计量方法进行相似性打分，取打分系数＞0.8所得的药物靶点为此次研究所需要的作用的潜在靶点，建立心可舒片候选靶点信息数据库。在疾病/症状靶点数据库，以“atherosclerosis”作为疾病或症状关键词进行检索，提取心可舒片中干预AS的药物名称、药物疗效、药物靶点的基因和蛋白质相关信息，作为候选靶点来源。 靶点网络。通过TCM-IP平台的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据库，获得心可舒片作用的潜在靶点与“atherosclerosis”疾病靶点之间的PPI信息并构建相互作用网络，以“节点连接度（degree）≥2倍中位数”为筛选条件，选取心可舒片靶点-疾病蛋白互作网络的节点（hubs）；接着，以“degree≥中位数”“紧密度（closeness）和介度（betweenness）均大于等于其中位数”为条件[11]，选取心可舒片干预AS的候选靶点；然后，通过对上述候选靶点所参与的功能和通路进行分析，并构建“复方-中药-成分-靶点-通路”的多层次网络关联图。 1.2.3 2 结果 2.1 心可舒片所含成分及其预测靶点信息 络中degree值最高的中药是山楂，degree值排在前10位的成分是棕榈酸、亚油酸、蔗糖、熊果酸、琥珀酸、花生酸、庚酸、壬酸、二十一碳酸和乌药酸，见图1。 2.2 心可舒片预测靶点生物信息学分析 2.3 心可舒片干预AS候选靶点网络构建 通过TCM-IP平台的PPI相互作用数据库，建立心可舒片药物靶点与AS靶点之间的相互作用网络，根据条件筛选出核心靶点461个，其中红色代表潜在药物靶点（putative drug target），灰色代表其他。根据degree排序仅显示排名前100的靶点得到心可舒片干预AS的候选靶点网络，见图3。节点的大小与degree呈正比关系，节点的degree值越大，说明这个节点在网络中的作用越大。其中，degree值排在前10位的基因分别是B4GALT4、B4GALT2、PRKCD、GCK、GNB1、ADCY2、CASK、ADCY5、PRKAA2、SSTR1。其中网络中连接度最高的节点为B4GALT4基因，表明B4GALT4相对应的蛋白在心可舒片干预AS的发生发展中具有重要作用。对前10位的基因进行Pathway的通路分析，选取Pathway的P≤0.05为有意义的通路。结果显示与钙调蛋白、G蛋白、γ-氨基丁酸通路密切相关，见图4。 2.4 心可舒片干预AS关键靶点生物信息学分析及“成分-靶点-通路”多维网络关系构建 对候选靶点进行GO富集分析，P值排名前20的候选靶点功能信息主要涉及MAPK级联反应、免疫过程、氨基酸代谢等多个生物学过程；胞外体、线粒体、髓鞘等多个细胞组分蛋白激酶结合、ATP结合和药物应答等多个分子功能（图5-A）；对候选靶点进行Pathway富集分析，P值排名前20的候选靶点通路信息主要涉及内分泌系统中甲状腺激素、雌激素，神经系统中神经传导、谷氨酸能突触，免疫系统中趋化因子，循环系统和细胞生长和死亡等通路（图5-B）。通过上述分析，借助TCM-IP平台建立心可舒片干预AS“成分-靶点-通路”多维网络，见图6。心可舒片干预AS的成分共80个，丹参中15个、三七中37个、山楂中19个、葛根中7个、木香中9个。研究表明，丹酚酸B可通过抗氧化、抗炎和抑制TLR4-NF-κB-TNF-α通道，而影响AS[13]；三七总皂苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1均有抗AS作用[14-16]；槲皮素可激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路，起到抗AS作用[17]；棕榈酸能够升高血浆游离脂肪酸水平，熊果酸可能通过调节血脂，抑制炎症反应以及降低氧化应激损伤而对AS大鼠表现出一定的保护作用[21]；染料木黄酮可以结合雌激素受体进而抑制血管内皮细胞和平滑肌细胞内细胞核因子-κB（NF-κB）活性及炎性细胞因子分泌，减少血管内皮细胞及平滑肌细胞增殖和转移，抑制AS的形成[22]。 2.5 心可舒片干预AS网络机制探讨 对“成分-靶点-通路”网络中取P值排名前5的通路内分泌系统（endocrine system）、甲状腺激素信号通路（thyroid hormone signalingpathway）、神经系统（nervous system）、雌激素受体信号传导通路（estrogen signaling pathway）和趋化因子信号通路（chemokine signaling pathway）中富集的基因进行韦恩分析，见图7。其中，5条通路的共有基因13个：HRAS、RAF1、PLCB2、MAPK3、PLCB3、KRAS、AKT1、PIK3R1、AKT3、PRKACA、PIK3CG、MAP2K1、SRC。将这13个基因带入KEGG Mapper，分析得到共有机制，结果显示心可舒片干预AS的机制与干预PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途径密切相关，见图8。 3 讨论 AS是危害人类健康的主要疾病之一，随着现代医学治疗方法的不断发展，其病死率呈现下降趋势，但死亡总数仍在不断增加[23]。现代医学认为“损伤反应学说”是AS发病的主要机制。其发病机制的主要过程首先是内皮损伤，其次是脂质积聚[3]，而粥样斑块的形成是动脉对内皮损伤反应的结果。AS属于中医“胸痹”“脉痹”“真心痛”等病症范畴，气滞血瘀证是其主要证候之一[3]。心可舒片由丹参、葛根、三七、山楂、木香5味药物组成，具 有活血化瘀、行气止痛的功效。2017年发布的《动脉粥样硬化中西医结合诊疗专家共识》中明确了心丹参、山楂和丹参、葛根药对于大鼠AS的发生发展具有良好的干预作用，作用与调节血脂水平、强抗氧化作用以及增强内皮功能有关[25]；臣药葛根中黄酮类有效成分降低了AS病变内巨噬细胞凋亡，抑制AS斑块的进展[26]。但国内外对心可舒干预AS的研究尚不足。因此，探究心可舒片用于AS的药效和机制研究对于心可舒片的进一步开发和应用具有十分重要意义。 和内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）等多个靶点。Akt磷酸化后可以促进eNOS活化，使内皮细胞产生NO增多，NO具有抑制血小板聚/ eNOS途径在AS的发生发展中起着至关重要的作用，抑制该途径，可延缓AS的形成及进展。研究表明，其中丹酚酸B可通过PI3K-Akt信号通路干预大鼠心肌缺血再灌注损伤[34]；人参皂苷Rg1通过PI3K/Akt/eNOS信号通路调控异丙肾上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌的抗氧化作用[35]，但对于AS中信号通路的影响尚未见报道。 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPKs可将细胞外刺激信号转导至细胞内及核内，而引起细胞的增殖、分化、转化及调亡等各种生物学反应[36]。ERK是MAPKs中的重要成员之一，可被炎性刺激激活，通过相应的下游信号分子调节多种内皮细胞的迁移、分化和增殖。Raf以级联反应的方式调节相关靶蛋白，形成经典Raf/MEK/ERK途径。Raf/MEK/ERK途径可由活性氧（ROS）、Ca2+、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等激活，并参与体内多种生理生化功能，对细胞生长、增殖、分化、凋亡均有影响[37]。Raf/MEK/ERK途径目前在肿瘤治疗、神经保护方面研究较多，对抑制Raf/MEK/ERK途径来抑制肿瘤的发展己经成为肿瘤开发药物的新方向，但鲜有其在AS方面的研究。 PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途径广泛存在于体内各种细胞，在血管内皮细胞的多种功能中起重要作用[38]。本研究结果首次提示心可舒片通过对PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途径的共同调节，保护血管内皮细胞，从而达到干预AS的效果，对于心可舒片的开发和应用具有十分重要意义。心可舒片干预AS的药效作用网络、方剂配伍关系仍需在病证背景下做进一步的实验验证。 参考文献（略） 来 源：李晓宇，徐 男，黄娜娜，吴成胜，刘闰平，郭文鹤，李晓骄阳，孙 蓉. 整合药理学方法的心可舒片干预动脉粥样硬化作用网络机制探讨 [J]. 中草药, 2018, 49(15):3463-3470.
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