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脑震宁颗粒是治疗脑外伤、脑震荡的常用药品，由丹参、陈皮、当归、川芎、牡丹皮等11味药组成，具有活血凉血、化瘀通络、益血安神、宁心定智、除烦止呕等功效，可用于脑外伤引起的头疼、头晕、烦躁、失眠、健忘、惊悸、恶心、呕吐等。其中当归、川芎、丹皮、地龙等可养血活血、凉血通瘀，枣仁、地黄、茯苓等可宁心定智、益气安神，竹茹可和胃降逆，主、辅、佐共同发挥作用[1]。 目前对脑震宁颗粒的药理药效研究较少，张明升等[2]研究了脑震宁的镇静和镇痛药效学作用，发现脑震宁能减少正常小鼠的自发活动次数，缩短戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的诱导期，显著延长小鼠睡眠时间，提高小鼠的痛阈和减少乙酸所致扭体反应。其他研究主要集中在脑震宁颗粒对脑外伤[1,3]、脑震荡[4]、颅内血肿[5]的临床疗效观察，证实其对重型颅脑损伤病人的头痛、头晕、失眠有良好的治疗作用[5]。然而，对脑震宁颗粒治疗脑外伤、脑震荡的作用机制目前尚未开展过相关研究。 融合系统生物学和多向药理学提出的网络药理学可构建药物-靶点-疾病之间的复杂网络，利用网络分析理论从整体角度研究药物作用机制，为中药多成分、多靶点的药物作用机制阐释提供了一种新的研究策略[6]。目前网络药理学已经用于远志[7]、六经头痛片[8]、大川芎方[9]等多种中药或复方的作用机制研究。王昊等[7]用网络药理学的方法发现远志中的多种活性成分通过调控Aβ的生成与细胞的凋亡起到治疗阿尔茨海默病的作用。董亚楠等[8]研究发现六经头痛片中18个化合物可通过72个作用靶标作用于88条通路，其作用机制与干预血管内稳态、炎症、神经中枢、免疫及激素调节等相关通路有关。本研究以脑震宁颗粒11味中药的主要成分为基础，运用网络药理学方法构建药材-成分-靶点-通路-疾病网络，系统预测其多成分、多靶点、多通路的作用特点，为进一步阐明其活性成分、作用机制以及发挥临床疗效的科学内涵提供依据。 1 材料与方法 1.1 活性成分的筛选及吸收、分布、代谢、排泄性质评估 通过查阅文献整理出脑震宁颗粒中每味药材的主要化学成分，同时利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，Phttp://ibts./LSP/tcmsp.php）对各成分的性质进行筛选，包括口服生物吸收利用度（OB）和类药性（DL）。利用PubChem数据库（https://www.ncbi.nlm./）下载各成分sdf格式的结构式，使用ChemDraw3D软件将其转为mol2格式文件保存。 1.2 靶点的预测 登陆DRAR-CPI（http://cpi./drar）服务器上传筛选得到的脑震宁颗粒候选成分的mol2格式文件，下载计算结果。对接得分（Z-score）代表活性成分与蛋白质的相互作用强度，设定蛋白靶点 1.3 靶点类型归属 menu，Version 5.0）是一个包含与人类疾病相关的基因和变异的数据库。选择靶点检索后，依次输入脑震宁颗粒相关靶点，得到靶点类型的相关信息。 1.4 靶点间相互作用分析 String数据库（https:///）是一个搜寻蛋白间相互作用的数据库。既包括蛋白之间的直接物理作用，也包括间接功能相关性。选择Multiple Proteins检索，输入脑震宁颗粒相关靶点，设定物种为人，得到靶点之间的作用关系。 1.5 靶点生物学功能注释分析 将筛选得到的脑震宁颗粒作用靶点导入Cytoscape 3.5.1软件ClueGo插件，通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，经检索和转化操作，设定阈值P＜0.05，用CluePedia插件进行绘图，进行GO生物学过程富集分析。 1.6 靶点通路注释分析 将筛选得到的脑震宁颗粒作用靶点导入DAVID数据库，通过输入靶点名称列表并限定物种为人，并将所有靶点名称校正为其正式名称（official gene symbol），经上述数据库检索和转化操作，设定阈值P＜0.05，用GraphPad Prism 5绘图，进行KEGG代谢通路富集分析，并将脑震宁颗粒对应的靶点直接映射到通路上，药物靶点富集的通路被认为是药物调控的通路。对其中富集的疾病部分进行MeSH（https://www.nlm./mesh/）分类分析。 1.7 药材-成分-靶点-通路-疾病网络构建 根据脑震宁颗粒潜在作用靶点的预测结果，采用Cytoscape 3.5.1软件的关联（Merge）功能构建脑震宁颗粒的药材-成分-靶点-通路-疾病网络模型。采用Network Analyzer功能对网络的度（degree）、中介度（betweenness centrality）、网络集中化（network centralization）和网络异质性（network heterogeneity）参数进行分析。网络中节点（node） 2 结果 2.1 脑震宁颗粒治疗脑外伤活性成分的初步筛选 由于目前尚无脑震宁颗粒活性成分的研究报道，因此对脑震宁颗粒11味组方药材的主要化学成分进行文献检索，并通过TCMSP数据库对这些成分的ADME性质进行分析，以OB≥30%和DL≥0.18为指标[10]进一步筛选。虽然部分成分（如阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯A等）OB值和DL值较低，或无OB、DL值报道（羽扇豆烯醇、羽扇豆烯酮等），但是这些成分在药材中含量较高，或研究显示其具有明显的药理作用，因此将这些成分也纳入后续的网络药理学分析，共得到10味药材的代表性化学成分33个（表1）。 2.2 脑震宁颗粒活性成分靶点的预测、类型归属及靶点之间作用分析 将脑震宁颗粒的33个代表性化学成分输入DRAR-CPI后返回各成分所对应靶点的chemical-protein打分值，以Z-score＜−1为阈值筛选后共得到349个靶点。在Uniprot网站输入这些靶点的PDB ID，共对应得到301个靶点。运用CooLGeN和Gene Card数据库搜索文献报道中与脑外伤（cerebral trauma）、脑震荡（brain concussion）、神经保护（neuroprotection、neuroprotective）、神经再生（nerve regeneration）相关的靶点，并与上述301个靶点进行对比分析，得到34个可能与脑震宁颗粒治疗脑震荡、脑外伤相关的潜在作用靶点（表2）。其中茯苓新酸A拥有最多的潜在靶点（10个），其次是茯苓酸B（9个）、藁本内酯（8个）、丹参酮I（7个）、槲皮素（6个）、α-雪松醇（6个）、没食子酸（6个）、丹皮酚（5个）、阿魏酸（5个）、洋川芎内酯A（4个），这些拥有较多靶点的成分对于脑震宁颗粒治疗脑外伤可能发挥关键作用。此外，1个靶点也可能对应脑震宁颗粒的多种化学成分，如靶点MAPK1对应的成分数量最多（15个），其次是IL10（10个）、CASP3（10个）、IL4（8个）、F9（8个）、GSK3B（7个）、HGF（6个）。 将脑震宁颗粒的34个潜在作用靶点依次输入DisGeNET数据库，得到靶点类型的相关信息。由表2可知，脑震宁颗粒的作用靶点类型包括信号分 将筛选到的靶点输入String数据库中，选择物种为人，得到靶点之间相互作用网络图（图1），该网络图包含34个节点、117条边，平均节点度为6.88，平均局部聚类系数为0.66。节点之间连线越粗，代表联系节点之间关联度越大。由图1可见，MAPK1、CASP3、GSK3B、JAK2、PLG、TNF等靶点的相互联系密切，说明脑震宁颗粒可能通过作用于多种靶点协同发挥药效作用。 2.3 脑震宁颗粒治疗脑外伤潜在作用靶点生物学功能注释分析 将脑震宁颗粒治疗脑外伤的34个潜在作用靶点通过Cytoscape3.5.1软件ClueGo插件进行GO生物学功能分析（图2）。GO是一个国际标准化的基因功能分类体系，包括3个分支，即生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞组分（cellular component）。脑创伤会导致线粒体产生大量活性氧（ROS），其生成过量可直接破坏ATP酶的结构、氧化ATP酶上的氨基酸，从而影响酶的活性，抑制ATP酶合成速率，导致ATP生成下降，影响线粒体能量转换过程，从而导致细胞凋亡[11]。重度脑外伤急性期容易激活内、外源性凝血系统，引起凝血功能障碍，进而表现为血液高凝状态、弥散性血管内凝血等，导致继发性脑出血。创伤、酸中毒、缺氧等因素能够造成组织内皮细胞出现损伤，影响内皮功能，一氧化氮（NO）作为血管的舒张因子，也是主要的神经递质，脑外伤时NO能够使脑部血流量增加，抑制血管痉挛[12]。GO分析结果显示，脑震宁颗粒治疗脑外伤的药效机制发挥可能与reactive oxygen species biosynthetic process、positive regulation of smoothmuscle cell proliferation、blood coagulation extrinsic pathway和neurotransmitter catabolic process等生物过程有关。 2.4 靶点通路注释分析 将脑震宁颗粒治疗脑外伤的34个潜在作用靶点通过生物学信息注释数据库（DAVID）进行KEGG通路注释。由图3可知，有7个靶点参与PI3K-Akt通路（占总靶点数量的21.2%）分别有5个靶点参与T cell receptor signaling pathway、MAPK signaling pathway、signaling pathways regulating pluripotency of stem cells及complement and coagulation cascades通路（占总靶点数量的15.2%），有4个靶点参与prolactin signaling pathway通路（占总靶点数量的12.1%），分别有3个靶点参与Fc epsilon RI signaling pathway、allograft rejection、Jak-STAT signaling pathway等通路（占总靶点数量的9.1%）。对注释得到的16条通路导入KEGG数据库进行通路分类，其中信号传导通路（signaltransduction）有5条，包括PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、mTOR signaling pathway和TNF signaling pathway；免疫系统（immune system）相关通路有5条，分别为complement and coagulationcascades、T cellreceptor signaling pathway、chemokine signaling pathway、Fc epsilon RI signaling pathway和natural killer cell mediated cytotoxicity；神经系统（nervous system）相关通路有3条，分别为cholinergic synapse、neurotrophin signaling pathway和serotonergic synapse；信号分子和交互通路（signaling molecules andinteraction）有1条，为cytokine-cytokine receptorinteraction；真核细胞群体通路（cellularcommunity- eukaryotes）有1条，为signalingpathways regulating pluripotency of stem cells；内分泌系统（endocrine system）相关通路1条，为prolactinsignaling pathway。 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是细胞内重要的信号转导通路。PI3K/Akt和MAPK信号通路经下游多种靶点，即内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、胱天蛋白酶-3（CASP3）、核转录因子-κB（NF-κB）、细胞外信号调节激酶等促进脑缺血后神经细胞的存活。PI3K/Akt和MAPK这2条信号通路在缺血性脑损伤中发挥重要作用，在一定条件下，这2条信号通路的激活可以通过上述途径有效抑制神经元细胞的凋亡而发挥脑保护作用[13]。JAK/STAT信号通路是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的共同途径，介导细胞增殖、分化、迁移、凋亡和免疫调节等多种生物学反应[14]。小胶质细胞在炎症反应引发迟发性神经元死亡中发挥重要作用。生理条件下，小胶质细胞处于静息或者休眠状态，在脑缺血、出血、外伤等病理状态下，小胶质细胞迅速活化、增殖，引发T细胞介导的免疫反应，参与脑损伤的病理生理学过程[15]。有研究发现JAK/STAT信号通路可以介导神经节苷脂刺激小胶质细胞激活，通过抑制JAK/STAT信号通路，减轻小胶质细胞的炎性反应[15]。mTOR信号通路参与调节体内细胞生长、分裂、代谢、蛋白质合成、自噬等一系列生理功能，同时在中枢神经系统中发挥重要作用。有研究发现mTOR信号通路抑制剂可通过激活自噬，从而发挥神经保护作用[16]。说明脑震宁颗粒治疗脑外伤的机制与其对多种代谢通路的调节相关。 2.5 药材-成分-靶点-通路-疾病网络构建 采用cytoscape软件的File功能构建脑震宁颗粒的药材-成分-靶点-通路-通路KEGG分类-疾病的网络模型（图4）。该网络有81个节点（包括1个中药复方、10味中药、33个成分、15个靶点、16条通路、6个通路分类和1个疾病）和205条边，其中橘色节点代表中药、蓝色节点代表成分、红色节点代表靶点、绿色节点代表代谢通路、紫色节点代表KEGG通路分类、边代表相互作用关系。进一步对该网络模型进行网络拓扑属性分析，其网络集中化（network centralization）和网络异质性（network heterogeneity）参数分别是0.252和0.657。 网络分析中关注最多的是度和介数，度是一个节点与其他相连的节点数，一个节点的度越大，则说明与之相连的节点数越多。中介度指的是通过该节点的最短路径占全部路径的比例。度和中介度越大，该节点越重要。图4中蓝色节点为成分，其颜色和大小与度相关，节点颜色越深、节点越大代表成分度越大，结合表1所列各成分的度值可知，茯苓新酸A、茯苓酸B、槲皮素、α-雪松醇、常春藤皂苷元、羽扇豆烯酮、常春藤皂苷元、丹皮酚、洋川芎内酯A等成分的度值较大，说明这些成分作用的靶点数量较多。红色节点表示靶点，其面积大小与度相关，节点面积越大，代表靶点度值越大，与其相连的成分数量越多，该靶点越可能是药物作用的主要靶点。靶点MAPK1（degree：15；Betweenness：0.28794203）、IL10（degree：10；Betweenness：0.14943692）、IL4（degree：10；Betweenness：0.1604573815）、CASP3（degree：7；Betweenness：0.10462409）、GSK3B（degree：6；Betweenness：0.02289136）等拥有较高的度值和中介度值，表明这些靶点可能为脑震宁颗粒治疗脑外伤、脑震荡的关键靶点。 2.6 脑震宁颗粒治疗脑外伤潜在靶点对应疾病及其MeSH分类 通过生物学信息注释数据库（DAVID）对脑震宁颗粒34个潜在作用靶点进行疾病分析，将其中富集的疾病部分进行MeSH分类。由图5所示，脑震宁颗粒治疗脑外伤潜在作用靶点所对应的疾病主要是神经系统疾病和精神障碍。其中精神系统疾病包括脑缺血（brain ischemia）、脑卒中（stroke）、偏头痛症（migrainedisorders）、痴呆（dementia）、脑肿瘤（brain neoplasms）和阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）；精神障碍类疾病包括重性抑郁障碍（major depressivedisorder）、情绪障碍（mooddisorders）、自闭症（autism）和精神分裂症（schizophrenia）。由此推测，除了脑外伤、脑震荡，脑震宁颗粒还有治疗其他神经系统疾病和精神障碍类疾病的潜在作用，这与其活血凉血、化瘀通络、益血安神、宁心定智、除烦止呕功效密切相关。 3 讨论 脑外伤的病理生理机制复杂，自由基反应、炎症反应及细胞凋亡等均是脑外伤后继发性脑损伤的重要原因[17]。脑外伤后，自由基大量产生，炎症反应加剧，导致神经细胞凋亡，从而进一步加重外伤性脑损伤，影响预后[18]。脑震荡属于轻型脑外伤，是最常见的脑损伤之一。 氧化应激是创伤性脑损伤的关键因素，已有文献报道[17-18]氧化苦参碱、柴胡皂苷等化合物可通过MAPK信号通路减少脑氧化损伤，从而改善神经功能和认知功能，降低脑水肿和血脑屏障通透性[19]。 脑损伤能诱导促炎因子IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、髓过氧化物酶（MPO）的表达增加和抗炎因子arginase-1和IL-10水平增加[20]，而炎症因子水平的高低不仅影响脑外伤后的认知功能，而且与脑外伤的预后有一定相关性[19]。有研究发现，丙酮酸乙酯可以减少脑外伤后大鼠血脑屏障的渗漏，抑制小胶质细胞的过度激活，降低多种炎症介质如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1α、IL-1β、环氧合酶-2（COX-2）和iNOS mRNA水平，减少脑外伤后的轴突损伤和髓鞘脱失，并对少突胶质细胞祖细胞具有显著的保护作用，其神经保护作用机制与减轻脑另有研究发现，外周血超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）、IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平可显著影响神经细胞凋亡进程[18]。NO在中枢神经系统的生理病理中起着重要的作用。过量NO与缺氧缺血脑损伤后的炎性反应、兴奋性毒性及神经元的死亡有关。缺氧缺血脑损伤时，iNOS（NOS2）和神经元型一氧化氮合酶（nNOS）催化神经元产生过量NO，诱导神经元凋亡[23]。脑震宁颗粒中的木栓酮、木栓醇等成分与iNOS相关，说明脑震宁颗粒可通过调控NO的生成缓解脑外伤后炎症反应。颅脑外伤会导致患者脑组织损伤出现一系列病理生理变化，其中认知功能是脑外伤常见的并发症之一[24]。Tau蛋白是维系神经元骨架系统稳定的重要分子细胞内靶点，CASP3和糖原合成酶激酶-3β（GSK3B）共同调节Tau蛋白磷酸化水平，抑制GSK3B可显著改善多种因素诱导的Tau过度磷酸化及动物认知障碍，从而改善脑外伤患者的认知障碍[7,25]。脑震宁颗粒中丹参酮I、橙皮苷、茯苓新酸A、茯苓酸B等成分可潜在作用于CASP3和GSK3B，说明调控Tau的过度磷酸化可能与脑震宁颗粒的作用机制相关。 单胺氧化酶可催化单胺类物质发生氧化脱氨反应，其中单胺氧化酶A（MAOA）主要分布在儿茶酚胺能神经元中，抑制MAOA可增加5羟色氨（5-HT）和多巴胺（DA）浓度[26]。脑外伤后最常见的社会心理问题是抑郁，有研究显示脑外伤后1年抑郁障碍的发病率高达12.8%，占脑外伤所致各类精神障碍之首，明显高于一般人群[27]。脑震宁颗粒中洋川芎内酯I可作用于MAOA，说明脑震宁颗粒对脑震荡、脑外伤后抑郁可能具有一定的改善作用。 Janus激酶（JAK）是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，脑缺血再灌注损伤后可引发JAK2的活化，缺血再灌注损伤后凋亡细胞也显著增多，JAK2特异性抑制剂AG490可以阻断JAK2的磷酸化，具有抗细胞凋亡作用[28]。脑震宁颗粒中丹参酮I、丹参酮IIA、槲皮素、川陈皮素等成分与JAK2相关，说明脑震宁颗粒可通过抗细胞凋亡来发挥药效作用。葡萄糖脑苷酯酶（GBA）是一种可溶性的糖脂类物质，是细胞的组成成分之一，当溶酶体中β-葡萄糖脑苷脂酶活性降低时，葡萄糖脑苷脂不能被水解而聚积在脑组织溶酶体及单核-巨噬系统中，导致细胞失去原有的功能而产生脑损伤症状[29]。脑震宁颗粒中木栓醇、羽扇豆烯醇、羽扇豆烯酮等成分有可能作用于GBA，推测脑震宁颗粒可通过加速葡萄糖脑苷脂的降解来缓解脑损伤症状。胱硫醚β-合酶（CBS）是脑内产生硫化氢的主要酶，CBS产生的硫化氢参与了缺血性脑损伤的病理生理过程[30]。脑震宁颗粒中作用于该靶点的成分有木栓醇、酸枣仁皂苷A等，推测脑震宁颗粒还可能通过调控硫化氢的生成来缓解缺血性脑损伤。纤溶酶原（PLG）活性在脑缺血再灌注期间呈明显进行性下降，乌司他丁能防止脑缺血再灌注损伤引起的纤溶酶原进行性下降，提示其有维持血浆抗凝功能及纤维蛋白溶解系统稳定的作用，对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用[31]。脑震宁颗粒中茯苓新酸A、茯苓酸B、去氢土莫酸、常春藤皂苷元、没食子酸等成分可能作用于该靶点，推测脑震宁颗粒还可通过调节PLG活性缓解脑缺血症状。 本研究以脑震宁颗粒的主要成分为基础，通过DRAR-CPI数据库中的chemical-protein相互作用并借助GooLGeN及GeneCard数据库检索分析，发现MAPK1、CASP3、GSK3B、IL10等34个脑震宁颗粒治疗脑外伤的潜在作用靶点，包括信号分子、受体、蛋白（免疫蛋白、钙结合蛋白等）、酶（蛋白酶、水解酶、激酶、转移酶、氧化还原酶）等。对靶点的GO富集分析和KEGG通路注释提示脑震宁颗粒可能通过活性氧的生物合成、平滑肌细胞增殖等生物过程发挥药效，其作用与PI3K/Akt、MAPK、JAK/STAT、mTOR等信号转导通路相关。通过构建药材-成分-靶点-通路-疾病网络，进一步推测脑震宁颗粒的作用机制与调控氧化应激、抑制炎症反应和细胞凋亡、调控Tau的过度磷酸化、调节脑内硫化氢生成和PLG活性、改善认知功能及脑外伤后抑郁等相关。其中茯苓新酸A、茯苓酸B、丹参酮I、丹参酮IIA、洋川芎内酯I、常春藤皂苷元、槲皮素、苯甲酰芍药苷等成分与脑震宁颗粒可能的作用机制密切相关。本研究从网络药理学的角度系统揭示了脑震宁颗粒多成分、多靶点、多通路的作用机制，为进一步深入研究其药效物质基础及作用机制奠定了基础。 |
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