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在发生癌变的细胞里，由于基因表达上的不同，很多关键性的调控酶功能出现异常会导致下游的代谢物发生变化，进而导致了细胞的癌变。在遗传性平滑肌瘤病与肾细胞癌（HLRCC）这种疾病中，由于延胡索酸水合酶发生突变，细胞内的延胡索酸会大量的积累，进而影响双水合酶的功能，或自身作为亲电分子修饰在蛋白上形成琥珀酸酯化的修饰从而影响蛋白的功能，最终导致细胞发生癌变。但在这样的过程中，延胡索酸修饰的底物研究还只停留在少数几个蛋白上，在组学层面上对遗传性癌症中这一修饰的底物还没有组学上的研究。本篇文章就是采用TOP-ABPP的技术对延胡索酸修饰的底物系统的进行了研究。 为了建立延胡索酸的竞争质谱方法，他们首先加入延胡索酸，并用琥珀酸酯化的抗体验证了延胡索酸确实可以修饰在蛋白质组上，他们采用的延胡索酸带有炔基的探针同样也有信号响应，但是信号的强度要略高于延胡索酸的本体分子，另外这一探针不但可以被延胡索酸竞争，还可以被其他亲电试剂MMF等竞争。之后他们选择碘乙酰胺（IA）探针标记，并用延胡索酸分子进行竞争，他们发现延胡索酸分子与其他类似的亲电试剂又不一样的竞争关系，所以他们决定要运用IA探针标记，延胡索酸竞争的方法对琥珀酸酯化修饰进行研究。 为了探究延胡索酸在癌症中的靶点，他们分别选取延胡索酸水合酶突变的癌症细胞和正常细胞，同样用IA标记，观察延胡索酸的升高对于半胱氨酸活性的影响。通过对比，他们找到了684个被延胡索酸调控的半胱氨酸，这其中就包括之前已经鉴定到的ACO2，并且ACO2的变化值只能算是中等水平。他们将他们得到的结果与之前二甲基延胡索酸底物的结果对比，发现只有很小的一部分重叠：延胡索酸更多修饰在线粒体蛋白中。随后他们将鉴定到的蛋白与高活性的半胱氨酸进行对比发现两者不太重合，这与之前证实的延胡索酸反应性不好，要很高浓度才能共价结合的结论是吻合的。 文章为了更深入的了解延胡索酸修饰的机理，对他们鉴定到受延胡索酸影响的活性半胱氨酸的序列进行了分析。与以往的亲核半胱氨酸不同，这些半胱氨酸周围的环境一般是偏酸性的，存在大量的谷氨酸和天冬氨酸。这让他们认为酸性条件很可能是细胞内延胡索酸修饰的必要条件，后续的生化试验也证实了没有这样的酸性条件，延胡索酸很难反应在半胱氨酸上。 在这之后他们对于这些底物在生命活动中起到的功能做了研究，与之前他们在HLRCC疾病病人的基因测序的结果相结合，他们发现这些蛋白底物与肾脏癌变的许多通路都有关，并且有很多都是调节蛋白相互作用的关键蛋白，在这些蛋白中他们选择SMARCC1作为研究的对象。他们通过化学生物学和计算机模拟的方法发现延胡索酸修饰发生在该蛋白与另外一个下游蛋白的接触界面，改变了两个蛋白的结合方式，进而改变了通路的运行。 综上所述，本文开发了一种竞争性的琥珀酸酯化修饰的质谱鉴定手段，但是这种方法还是比较间接，更为直接的研究琥珀酸酯化修饰的方法还要后续的开发。
作者：LZH |
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