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来源：探肝 “HBV感染者患肝癌的风险是未感染者的100~200倍” “HBV 阳性肝癌在男性中发病率是女性的6倍之多” 这惊人的统计结果背后，有哪些不为人知的秘密，幕后黑手 HBV 如何悄悄杀死了肝脏，又为何更青睐男性呢？带着这些疑问，让我们一起来到破案现场，通过3起“案宗”拨云见日，揭秘HBV的滔天罪行。 案件背景 肝癌是我国发病率第三位的恶性肿瘤，五年生存率仅为10%左右，包括两种主要病理组织学类型，分别为肝细胞癌 HCC 和肝内胆管细胞癌 iCCA，其中HCC 占我国肝癌总数的 83.9%～92.3%。其风险因素主要包括病毒感染（HBV、HCV），脂肪肝，酒精肝，黄曲霉毒素等。据统计我国约有 HBV 感染者 1.2 亿，占我国总人口的 9.09%，其中有 1/4 是慢性乙肝患者，大约是 3000 万人。 关于HBV 致瘤的机制尚不清楚，可能通过以下 3 种不同的机制：一是病毒 DNA 整合宿主基因组后引起染色体不稳定，进而在很多位点发生杂合性缺失；二是 HBV 整合入宿主基因组某些特定区域，造成插入突变从而激活原癌基因；三是表达的病毒蛋白可以调控肝细胞的增殖与活性，其中主要是 HBX 蛋白。 1 中国首个高精度肝癌全基因组 HBV 整合图谱 为探究肝癌全基因组范围内的 HBV 整合事件，2012年 Nature Genetics上发表了一篇文章，收集了 81 例 HBV 阳性和 7 例 HBV 阴性中国肝癌患者的样本，对其进行WGS 与 RNA 测序 ，首次构建了中国肝癌患者的高精度 HBV 病毒插入图谱，阐明了病毒插入所引起的宿主染色体结构和基因表达改变，并研究了HBV 插入事件数目与患者生存期之间的关系，为肝癌的早期诊断、治疗与靶向药物开发提供理论指导。研究思路如下：  文章利用同时比对上人和HBV基因组的双端reads 进行聚类分析，共检测到399个HBV插入位点（图1），其中 209个HBV插入位点分布在人基因组的编码区附近，可能因为这些基因分布在染色体开放区，使得病毒易于插入；插入的病毒序列多为病毒启动子，X基因及核心基因等。同时，使用PCR 与 RNA-seq 对这些插入位点进行了验证。此外，研究者还分析了病毒插入位点的分布情况，结果显示肝癌样本中共发生344个插入事件（最多的1个样本有17个插入），其中179个插入位点分布在编码区内；正常样本中只有55个插入事件，其中33个插入位点分布在内含子区。说明肿瘤样本中的插入位点多分布在基因的外显子和启动子区域，而正常组织中的插入位点多分布在 intron 区，二者病毒插入模式偏好性不同，推测与正选择有关。 图1 HBV 分别在HCC患者中的插入位点 注：图1中每个 bar 代表HBV的插入位点，红色、蓝色分别代表插入在基因区、基因间区。长度代表发生该插入事件的样本数； 分析病毒插入位点相关的基因，共鉴定出6个高频基因，分别为：TRET、MALL4、CCNE1，2个新发现的基因 SEN5、ROCK1，以及仅在正常样本中发现的FN1（图2）。RNAseq 数据分析结果表明，除 FN1外，上述基因的表达量在肿瘤样本中较高。  图2 HCC中高频插入位点相关的基因 注：图2中每个红色箭头代表有一个样本在此处发生了病毒插入。 在HBV插入位点附近检测到648个CNV 事件，且 CNV 数目与 HBV 插入位点数呈正相关，说明 HBV 插入可能破坏染色体的稳定性，引起拷贝数的变化。 作者进一步研究 HBV 插入与患者预后之间的关系（图3）。根据 HBV 插入事件是否大于 3，将患者分为NHBV < 3与NHBV > 3组。结果发现：NHBV > 3组患者具有更高的 HBsAg和AFP水平(图3a)；年轻患者中HBV 插入事件更多 (图3b)；NHBV > 3组患者的生存期更短。大量的 HBV 整合与低生存率和高 AFP 水平相关。  图3 HBV 与 HCC 患者临床特征的关系 注：a、b、c 分别表示 HBV 插入位点数目与 AFP 水平、患者年龄，生存期的关系， 2 426 例肝癌患者中 HBV 整合的偏好性及致癌机制 之前的研究表明 HBV 病毒在 HCC 基因组的插入位点具有一定的偏好性，也鉴定出了多个常见的高频病毒插入基因（TRET、KMT2B、CCNE1），但这仍然只是部分高频基因。2016年 Nature Communication上发表了一篇文章，采用了更大的研究队列，对 426 例 HBV 相关肝癌患者的样本进行病毒靶向捕获测序 （298肝硬化vs 128无肝硬化，360男vs 66女），在宿主基因组中发现了更多的 HBV 整合位点，以及与性别，肝硬化相关的分子特征，研究思路如下：  文章共检测出 4,225 个 HBV 整合位点，这些断点优先整合在染色体脆弱区域及包括CpG岛在内的功能区（图1）。肿瘤样本与正常样本中分别有 3,486 个和739个整合位点。随机选择了12个肿瘤组织样本进行 RNA 测序，从转录本水平上验证 HBV 整合断点，并发现位于 HBV 整合位点的癌基因表达水平发生了改变。  图1a. 426 例配对样本中 HBV 病毒插入位点的分布图; b. 426个配对样本在CpG岛上的真核位点比较； c. 426个配对样本在染色体脆弱区域FR整合位点的分布； 作者进一步研究了每条染色体上 HBV 的插入情况，发现肿瘤样本中插入主要发生在 5,16,17,19号染色体上，说明病毒插入在染色体水平上存在一定的偏好性（图2）。并且肿瘤中病毒整合位点显著集中于端粒附近，而在正常组织中并未发现该现象。  图2. 426 例肝癌样本每条染色体及染色体末端2M区域内的病毒插入比率 注：绿色表示随机比率，蓝色为肿瘤样本中实际发生比率，紫色为正常样本中实际发生比率；红色* 代表正常组织与随机分布呈显著差异；蓝色* 代表肿瘤组织与随机分布呈显著差异。 研究者在肿瘤组织与正常组织中分别发现了 88 个、17 个基因与 HBV 整合相关，其中一部分在之前文献报道过，包括：TRET, MLL4, CCNE1，同时也新发现了 PTPRD, UNC5D, NRG3, CTNND2, AHRR 等基因，这些基因均与癌症发生以及癌症抑制等功能相关，并且其 RNA 与蛋白水平均发生了改变。 比较两组患者的临床特征，发现具有 HBV 病毒插入（BK>0）的 HCC 患者的生存期短于无病毒插入的患者(BK<0)，见图 3。以TRET 基因为例，显示了具有 HBV 插入患者体内的 TRET 表达量更高，生存期更短。  图3 HCC 患者中HBV 整合与临床特征的相互关系 文章进一步研究了HCC患者病毒整合与性别、临床病例特征之间的关系，见图4。研究发现HBV 病毒整合到肿瘤基因组的发生率，男性 HCC 患者明显高于女性 HCC 患者。研究观察到，在男性患者中，HBV 病毒偏向整合于第2、17号染色体的大量区域，而且，与女性HCC患者相比，男性患者 HBV 病毒偏向整合于核蛋白区域。  图4 HBV整合位点在男女 HCC 患者中的分布与差异 临床上，一些 HBV 相关的 HCC 患者发生肝硬化的几率较小，提示关键的致癌基因或肿瘤抑制基因与无慢性炎症的 HCC 发生有关。基因注释显示肝硬化依赖性 HBV 整合模式：在致癌基因或肿瘤抑制基因如KMT2B、CCNE1、AHRR基因附近，由非肝硬化发展成的 HCC 中 HBV 病毒的整合显著多于由肝硬化发展成的HCC，提示这些基因的激活或失活可能与无肝硬化的 HCC 的早发性有关。 3 雄激素对 HBV 相关肝癌患者的影响 大量数据表明与 HBV 相关的肝癌中男性比女性具有更高的发病风险，男女发病比率约为6:1，并且男女患者会显示出不同的临床特点。相关研究表明，雄激素能通过作用于病毒启动子 EnhI 中雄激素应答原件 ARE 促进 HBV 病毒的表达，而雌激素起抑制作用。2019 年 Hepatology 上发表了一篇文章，对 101 例 HBV 相关的 HCC 患者（男62 vs 女39）进行了靶向测序，研究结果表明男性患者具有更高频率的 HBV 病毒插入和TRET 124G>A 的突变事件。文章的研究思路如下：  文章设计探针捕获肝癌患者样本中的HBV 以及 TRET， TP53 等基因处的序列进行分析（图1A）。在 101 个样本中，有 94 个样本检测到 HBV 的插入，比例为93.1%（图1B）；图1中C图展示了 HBV 基因组中的整合热点，主要为 DR1 和 DRII 区域，与之前报道一致；D图和E图分别展示了人类基因组不同区域（外显子，内含子，启动子，基因间区）以及全部染色体上 HBV 的整合位点。除了病毒插入外，肿瘤样本中还检测到 TRET 启动子区和 TP53 编码区上的突变，突变频率分别为19.8%，37.6%，并采用 Sanger 测序进行了验证。 TRET 启动子区的突变与 HBV 插入 TRET 启动子区存在相互排斥的现象，这种样本有48例，比例为47.5%。  图1 101例样本上的病毒整合位点 为了检测 HBV 在宿主基因组上的整合位点是否具有性别差异，研究者统计了不同性别HCC 患者体内的病毒整合事件，结果显示无论病毒插入数目（图2A）还是病毒插入序列（图2B），均无显著差异。但是基于病毒插入位点在宿主基因组不同区域的分布情况进行统计，发现男性患者中发生在启动子区的病毒整合事件显著多于女性（图2C），尤其是 TRET 基因启动子区域内的病毒整合位点男性显著多余女性（22/58vs6/36, P=0.0285），而MLL4与CCNE1则不存在明显差异（图2D）。 图2 不同性别中的病毒整合位点差异 图 3 详细展示了男女肝癌患者中 HBV 整合位点以及基因突变事件的统计结果：A 图可以看出 TRET 的病毒插入与启动子突变相互排斥，B图可以看出 TRET 基因发生病毒插入和点突变的比率在男女性别中均存在显著差异（P<0.0001）。图4展示了TERT, MLL4, CCNE1基因中病毒插入的位点及表达量的变化情况：A-C图可以看出 TRET 的病毒插入位点集中在启动子区，而MLL4, CCNE1的病毒插入位点主要在内含子区；D-E图可以看出 TRET 发生病毒插入和启动子区突变都会导致 TRET 的表达量上升，病毒插入导致上升的幅度更大。病毒插入 CCNE1 后其表达水平也有上升，而 MLL4 的表达量在病毒插入前后无显著变化。 图3 不同性别中 TRET 病毒插入与突变结果 图4 TERT,MLL4,CCNE1的病毒插入与基因表达情况 作者进一步采用了荧光素酶报告系统进行了验证。图5说明了 HBV 病毒整合会促进TRET 的表达，雄激素可以促进这一过程，且该过程依赖 HNF4α （HBV病毒转录的关键因子）的参与；图6 说明了 TRET 启动子区域突变会促进 TRET 的表达，雄激素可以促进这一过程，且该过程依赖 GABPA 的参与。最后，文章根据上述结论提出激素-TRET-HCC作用模型（图7）。 图5 . 病毒插入TRET启动子区后，雄激素通过HNF4α促进其转录，而雌激素抑制此过程； A为野生型WT-TRET-Luc和病毒插入HBV-TRET-Luc的荧光素酶报告系统模型；B和C显示雌激素ER、雄激素AR分别对2个模型的影响； D显示了敲除HNF4α 后结果的影响； 图6 TRET 启动子突变后，雄激素通过GABPA促进其转录；A为野生型WT-TRET-Luc和TRET突变G(-124)A-TERT-Luc、G(-146)A-TERT-Luc的荧光素酶报告系统模型；B和C分别为雄激素和雌激素对3个模型的影响；D显示了敲除GABPA对结果的影响； 图7 TRET发生病毒插入和突变后促进男性形成HCC模型 本文研究结果表明，TRET过表达可作为HCC的潜在治疗靶标，比如针对TRET启动子区域有基因改变的男性患者可通过靶向雄性激素促进TRET这一生理过程阻断体内 TRET 的表达上升，从而治疗HCC。 文章总结 历经数年的研究和挖掘，HBV“谋害”肝癌的案件还存在很多的疑点尚未破解，需要我们积累更多的数据和开发更精确的分析技术来攻关，“革命尚未成功，同志仍须努力”。 参考文献 【1】Sung WK, Zheng H, Li S, Chen R, Liu X, Li Y, et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nat Genet 2012;44:765-769. 【2】 Zhao LH1,2, Liu X3, Yan HX1,2, Li WY, et al. Genomic and oncogenic preference of HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 2016 Oct 5;7:12992. 【3】Li CL, Li CY, Lin YY, Ho MC, Chen DS, et al. Androgen Receptor Enhances Hepatic Telomerase Reverse Transcriptase Gene Transcription After Hepatitis B Virus Integration or Point Mutation in Promoter Region. Hepatology. 2019 Feb;69(2):498-512. 《探肝》将持续跟进肝癌领域诊断、治疗、监测以及筛查等方向的最新进展，研究肝癌疾病机制，分析肝癌分子机理，分享最新肝癌科研和临床领域的新动向，解读肝癌领域顶级期刊的新文章！ |
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