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实验人员通过体外模拟病毒复制过程，以提取的RNA为模板，使用逆转录酶催化，合成出与RNA互补的cDNA链。最终构建cDNA文库，并从中筛选所需的靶标基因。 BUT！小伙伴们做逆转录实验时， 1）有没有深究过RNA逆转录出的cDNA能不能真实反映出基因表达信息？ 2）做实验时，有没有发生过内参做的很好，目的基因做不出的情况？ 如果有发生上述情况，那么需要重新评估逆转录实验结果的有效性。 逆转录结果有效性的评定 逆转录实验结果有效性的评定最重要的是尽可能反映样本中原始RNA模板的信息，即均一性地将RNA逆转录生成cDNA。理论上来讲，不考虑碱基组成的影响，均一性体现在不同位置处的片段同等效率地合成cDNA，进而保证真实地反映转录谱中不同基因的实际丰度。 逆转录实验的成功与RNA模板、逆转录酶、引物及反应程序等有关。当我们实验做不成功时，大家会优先从模板、逆转录酶来找原因，往往忽略引物在其中起的作用，其实引物对逆转录成败也至关重要。 今天小翊就跟大家讨论下逆转录引物的分类和选择。 逆转录引物有三类，Oligo dT引物、随机引物、基因特异性引物（GSP，Gene Specific Primer）。 Oligo dT引物： 若干dTTP组成的引物，可以和真核生物mRNA的Poly A尾配对，与模板结合特异性高。因该特异性，常适用于获取转录本靠近3’末端序列。它不适用于降解的RNA模板，也不适用于缺少A尾的RNA，如原核生物RNA和miRNA。当RNA模板降解时或RNA内部中有复杂二级结构时，会造成cDNA合成长度变短，无法有效合成靠近RNA 模板5’末端的序列。这是影响均一性的常见因素。 也常见Oligo dT序列的3’端存在几个锚定碱基，如常见的miRNA加尾法逆转录引物。 2)随机引物 随机引物是若干个碱基组成的寡核苷酸，如随机六聚体，5’-d（NNNNNN）-3’，是各种引物的混合物。它与模板结合的特异性低，可在整个转录本的多个位点退火，产生短的、部分长度的cDNA。常适用于获取转录本5’末端序列及二级复杂结构的区域。一般不建议用于长片段序列的合成。有文献报道15个碱基的随机引物比6碱基和9碱基随机引物转录出的cDNA产量和基因丰度更高[1] 3)基因特异性引物（GSP） 基因特异性引物（GSP）也即是反向引物，是与模板序列互补的引物，需要实验者根据实验需求自己设计合成，适用于目的序列已知的情况。若做一步法RT-PCR，只能用GSP引物。设计GSP的原则同PCR引物相同。 若研究真核基因时，可将Oligo dT与随机引物混合使用，集二者之长，得到的cDNA均一性更好。实验重复性也更高。 对三种引物有初步了解后，针对一些实验中遇到的问题，小翊给大家提供了实验建议。 实验建议 问题一：大鼠肝脏的RT-qPCR，逆转录用的是oligo dT引物，PCR时内参出的很好，就是目的基因不出，已经差不多一个月了。怎么办？ 小翊建议：根据Oligo dT引物介绍，具有明显二级结构的RNA也会破坏全长cDNA的合成，造成RNA 5’末端的代表性下降。同样的，RNA模板出现降解时，也会造成Oligo dT全长cDNA合成能力的下降。建议使用Oligo dT/随机引物的混合物作为逆转录启动引物。 问题二：RNA模板有降解怎么办？ 小翊建议：尽量选用RNA质量好的样本，但是如果条件不允许，建议用随机引物，适合poly A比较短或被降解的情况做逆转录。 问题三：RNA病毒研究用什么引物？ 小翊建议：在ＲＮＡ病毒的研究中一般用随机引物和基因特异性引物。一方面是病毒RNA没有ＰolyＡ的原因。另一方面，当复杂二级结构较多时，使用基因特异性引物有利于提高退火温度，打开二级结构，合成较长的cDNA片段。 好啦,逆转录引物的介绍就到这里啦,期望对小伙伴的实验有所帮助。 参考文献 [1] Stangegaard M1, Dufva IH, Dufva M.Reverse transcription using random pentadecamer primers increases yield and quality of resulting cDNA[J].Biotechniques,2006 May,40(5):649-57. |
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