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1 材料、仪器及试剂 1.1 材料 1.2 仪器 Acquity UPLC SynaptG2 HDMS系统（美国Waters公司，包括真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和ESI电离源Q-TOF检测器）。Dionex UitiMate 3000（Thermo Fisher科技有限公司），AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），数控超声波清洗器（KQ5200DE型，40 kHz，昆山市仪器超声有限公司），微孔滤膜0.22 μm（天津津腾有限公司），BJ150型高速多功能粉碎机（浙江湖州德清拜杰电器有限公司）。 1.3 试剂 2 方法 2.1 样品溶液的制备 苹果属植物叶片阴干，粉碎，精密称取约0.1 g样品粉末，放至10 mL量瓶中，加入适量70%乙醇作为提取溶剂，超声30 min后冷却至室温，再加入70%乙醇定容至刻度，摇匀，静置。吸取上清液用0.22 μm微孔膜滤过，取续滤液至液相小瓶中备用。 2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取根皮苷20.30 mg、三叶苷5.60 mg、根皮素5.10 mg、芦丁9.50 mg和槲皮苷10.10 mg于10 mL量瓶中，加入适量甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，静置，作为储备液。使用前分别精密量取适量体积的上述对照品溶液，混合，摇匀，作为混合对照品溶液。 2.3 UPLC-DAD色谱条件 Waters BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流动相为1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），柱温为40 ℃，体积流量为0.3 mL/min。洗脱程序：0～8 min，15%～35% B；8～10 min，35%～50% B；10～11 min，50%～100% B；11～12 min，100% B；12～13 min，100%～15% B；13～16 min，15% B。进样体积2 μL，检测波长280 nm。 2.4 线性关系考察 精密量取“2.2”项下混合对照品溶液适量，用甲醇作溶剂依次稀释，配制成一系列质量浓度梯度溶液。按照“2.3”项下色谱条件测定，并以质量浓度为横坐标（X），峰面积响应值为纵坐标进行线性回归，得到槲皮苷、根皮素、根皮苷、三叶苷和芦丁的线性回归方程，见表2。 2.5 定量测定 按照“2.3”项下色谱条件测定样品，并按照“2.4”项下线性回归方程分别计算样品中槲皮苷、根皮苷、根皮素、芦丁和三叶苷的量。 2.6 UPLC-Q-TOF-MS检测条件 2.1 mm，1.7 μm）。流动相为1%甲酸水（A）-乙腈（B），柱温为30 ℃，体积流量0.3 mL/min。洗脱程序为0～3 min，2%～4% B；3～4 min，4%～13% B；4～6 min，13%～15% B；6～7 min，15%～21% B；7～9 min，21%～22% B；9～10 min，22%～25% B；10～15 min，25%～60% B；15～16 min，60%～80% B。进样体积2 μL。 2.6.2 质谱条件 采用电喷雾正离子和负离子检测电离模式，雾化气为高纯度N2，碰撞气为高纯度He，质量扫描范围：m/z100～1 200。负离子模式锥孔电压40 V，毛细管电压2.4 kV，离子源温度100℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气体积流量900 L/h，锥孔气体积流量50 L/h，碰撞能量（CE）20～40 eV，LockMass：亮氨酸脑啡肽，m/z为554.261 5。正离子模式锥孔电压40 V，毛细管电压3.5 kV，离子源温度100℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气体积流量900 L/h，锥孔气体积流量50 L/h，CE 20～40 eV，LockMass：亮氨酸脑啡肽，m/z为556.277 1。 2.7 数据处理 将UPLC检测得到的样品数据导入SPSS（22.0版本）进行组间含量差异分析和整体聚类分析。将经超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-Q-TOF/MS）得到的样品数据导入Waters Masslynx 4.1软件中，在MakerLynx application managerVersion 4.1编辑，进行峰识别、峰对齐、基线校正和归一化等预处理，再将处理过的数据导入Progenesis QI（美国Waters公司）软件中，输出三维数据矩阵（由保留时间、精确相对分子质量和峰面积组成），最后将得到的矩阵导入Simca-P软件（13.0版本）进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析，对不同种系和不同产地的苹果属植物进行模式识别，寻找组间差异较大的植物代谢物。 3 结果与分析 3.1 UPLC检测分析结果 样品含量测定结果表明（表3），苹果属植物叶片中普遍含有根皮苷。槲皮素、根皮素和芦丁也广泛存在，三叶苷则只存在于少部分样品中。根皮苷量最高的是红花丽江山荆子（pgs-07），达17.15%；根皮素量最高的是山荆子（pgs-49），为0.11%；槲皮苷量最高的是锡金海棠（pgs-11），为0.16%；芦丁量最高的是小金海棠（pgs-46），为0.47%；三叶苷量最高的是湖北海棠（pgs-10），为1.50%。 用SPSS（22.0版本）计算苹果属植物叶片样本各组中5种成分含量分布范围，并对不同组系及不同产地的5种成分含量进行了组间含量差异分析，其结果显示（表4），样本中山荆子系中的5种成分含量均明显高于苹果系，苹果系中未能检测到三叶苷的存在；真正苹果组中的根皮苷、槲皮苷和芦丁含量高于花楸苹果组，但花楸苹果组的三叶苷含量高于真正苹果组，2组植物叶片中的根皮素含量相近；栽培种植物叶片中未检测到三叶苷存在，其他4种成分在野生种和栽培种中含量分布相近；来自北京市的样本三叶苷含量明显高于来自辽宁省兴城市的样本，其他4种成分在2个产地的植物叶片中含量分布相近。 将40个苹果属植物按照这5种成分的含量进行聚类分析，采用离差平方和法将含量接近的样品聚为一类，聚类结果显示样品分布没有明显的规律，与传统植物学分类也并不一致。 上述测定结果在一定程度上反映了不同来源苹果属植物叶片中这5种成分含量的差异，为了更全面揭示该属植物叶片的化学物质基础，本实验进一步采用无偏差的代谢组学进行分析。 3.2 UPLC-Q-TOF-MS代谢组学分析结果 代表性的苹果属植物叶片的UPLC-Q-TOF-MS总离子色谱图如图1和2所示，从轮廓图中可见不同样品间色谱图相似性较高，但也存在一定差异。如在正、负离子模式下，真正苹果组中的山荆子系和苹果系都存在主要色谱峰的差异。为了揭示不同来源苹果属叶片化学成分的差异，本研究利用统计学软件对数据做进一步处理。 PCA得分图中，样品分布点越靠近，表明样本中所含有的变量组成及含量越接近。苹果属植物野生种2个组（花楸苹果组和真正苹果组）的PCA得分散点图（图3-A）中，第1主成分和第2主成分共解释了64.6%（PC1：46.7%，PC2：17.9%）的原始变量信息。从图3-A中可以看出，pgs-9（垂瓣垂丝海棠）和pgs-10（湖北海棠）为2个异常样本值，可能是由于检测不当所造成；花楸苹果组的部分样品pgs-41（红三叶海棠）和pgs-44（陇东海棠）与真正苹果组有分离趋势，而其余3个样本pgs-13（小金海棠）、pgs-45（变叶海棠）和pgs-46（小金海棠）未与真正苹果组的样本得到分离。 在真正苹果组植物的山荆子系和苹果系PCA得分散点图（图3-B）中，第1主成分和第2主成分共解释了70.4%（PC1：53.0%，PC2：17.4%）的原始变量信息，2组植物之间有个别种未得到分离，但总的来说具有较明显的分离趋势，说明2组植物的化学成分存在一定的差异。此外，从PCA得分图中还可以看出，当苹果属内组间比较时，山荆子系和苹果系之间差异不明显，当去除花楸苹果组，真正苹果组中的2个系得到了较好的分离。 为根据PCA载荷矩阵投影图（图5-A）、S-Plot图（图5-B）及VIP＞1.5相对应的变量对山荆子系和苹果系之间的差异化合物进行了分析鉴定，鉴定结果如表5所示。共找出26个差异化合物，鉴定出21个化合物，5个化合物未鉴定出，其中化合物槲皮苷、槲皮素、根皮素、根皮苷、三叶苷、金丝桃苷、香草酸、vanillyl mandelic acid、山柰酚、表儿茶素和没食子酸均已在文献中有过报道[5]，其他化合物未见与苹果属植物叶片相关的报道。化合物根皮苷、根皮素、槲皮苷和三叶苷在“3.1”项下已经过UPLC-DAD检测，同时也是代谢组学分析出的差异化合物，因此进一步对这4种化合物在山荆子系和苹果系中的含量进行比较验证。代谢组学结果显示4种成分在山荆子系中平均含量都明显高于苹果系（图6），其中根皮苷、根皮素和槲皮苷与UPLC-DAD分析结果相一致，但在UPLC-DAD检测中未在苹果系中检测到三叶苷的存在，可能是由于该化合物含量低于检测限所致。由于野生花楸苹果组样品数过少，进行组内统计分析得到的结论会存在一定的偏差，因此未做下一步分析。 PCA
3.2.2 基于UPLC-Q-TOF-MS正离子检测数据的苹果属植物叶片化学成分多元统计分析结果 UPLC-Q-TOF-MS正离子检测数据由Progenesis QI分析处理后，共得到903个变量。对其分组进行PCA时发现，北京市的样品和辽宁省兴城市的样品在该模式下能够得到有效分离。如图8所示，在得分散点图中，第1主成分和第2主成分共解释了65.2%（PC1：47.0%，PC2：18.2%）的原始变量信息，来自辽宁的样品组和来自北京市的样品组有明显的分离趋势。PLS-DA交互排列模型验证结果（图8-A）（R2X＝64.9%，R2Y＝83.4%，Q2＝76.8%）说明2个组之间既有相似性又有差异性。OPLS-DA模型分析结果（图8-B）也表明除样本pgs-13（小金海棠）有一定偏离外，北京产地和辽宁产地2个组的样品分离趋势较为明显，经分析也发现了2个产地间的差异化合物，然而结构未能得到有效鉴定。在正离子模式下，也按照传统形态学对样本分组后进行了PCA，结果显示不同组系的苹果属植物并未得到有效分离，故未对其进行下一步分析。
4 讨论 苹果属作为蔷薇科的一个大属，自1754年成立以来，已经有了260多年的研究历史。过去的研究主要集中于该属植物的分类、花果化学成分分离和果实品质提升等内容上，只有少部分研究涉及到叶片化学成分，但也仅关注主流栽培品种的一些黄酮类化合物，不同野生种和栽培品种之间的化学成分差异没有系统性的研究报道。本实验广泛取样，首次采用UPLC-DAD技术结合UPLC-Q-TOF-MS代谢组学技术对40份苹果属植物叶片提取物进行了详细比较，发现苹果属不同种（品种）、不同产地来源的植物叶片化学成分存在一定的异同，为该属植物叶片资源的利用提供了一定的科学依据。 从UPLC-DAD含量测定数据分析结果来看，苹果属分类学上不同组植物的叶片5种成分含量有较大差异。栽培种中的5种成分含量比野生种的更为稳定，以根皮苷为例，野生种的根皮苷含量变化为1.01%～17.15%，而栽培种为7.77%～12.38%；与野生种相比，栽培种15个苹果叶片样品中均未检测到三叶苷的存在，但其他4种成分含量未见两组有明显差异；花楸苹果组和真正苹果组的5种成分含量高低相差较大，但分布没有明显规律可循。相同组不同系内同一种成分含量也有所不同，山荆子系中5种成分含量均明显高于苹果系，同时在苹果系的8个种叶片中未检测到三叶苷的存在，推测三叶苷可能为山荆子系与苹果系差异性成分；在所检测的苹果属40个种叶片中，根皮苷含量最大，分布也最为广泛，这与文献报道的根皮苷为苹果属植物特征化学成分相一致[18]。 UPLC-Q-TOF-MS分析结果表明，山荆子系与苹果系之间的差异能够明显区分，这与分类学上的内容基本一致，也与UPLC-DAD含量检测结果相对应，在差异化合物鉴定时，可能受到了化合物离子化的局限，未鉴定到芦丁的存在；不同产地苹果属植物叶片之间存在着较大差异，但未能鉴定出差异化合物，这可能与正离子模式下所能检测到的化合物性质有关；基于苹果属叶片的植物代谢组学分析并没有完全区分野生种与栽培种，与先前的苹果属植物叶片相关文献报道相符合[14]。当然，由于本研究样品采样时间都在成熟期，研究结果只能反映出这一时期内的化学成分差异，存在一定的局限性；另外，苹果属的多胜海棠组和滇池海棠系植物叶片样本由于各种原因未采集到，因此其叶片的化学成分还需进一步研究。 我国苹果属植物资源丰富，栽培面积大，品种繁多，目前已有少数种（品种）的叶片在提取物、食品和保健食品中得以初步开发和利用，然而大部分资源未能得到有效利用，如海棠类的植物也都只发挥了其园林观赏价值。利用药用植物亲缘学（pharmaphylogeny）理论，基于已有的研究和应用报道为线索，挖掘其叶片的食用和药用价值，可进一步扩展苹果属植物资源的综合利用。 志谢：所用苹果属植物样品在采集中得到中国农业科学院果树研究所王昆研究员、李壮博士和北京农学院秦晓晓博士的大力帮助！ 参考文献（略） 来 源：李 珮，申 洁，毕 武，何春年，肖培根. 苹果属植物叶片的代谢组学分析及5种成分的含量测定研究 [J]. 中草药, 2018, 49(22):5378-5387. |
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