野生型prelamin A表达的小幅增加足以重现在表达progerin的细胞中观察到的细胞增殖减少和核膜形态改变，progerin是与早衰相关的突变体lamin a。我们假设这些表型在表达水平升高的野生型prelamin A或progerin的细胞中的表现是由相同的分子效应物引起的，其在progeroid表型的发病中起重要作用。为了通过实验验证这一假设，我们比较了表达progerin的同基因二倍体成纤维细胞或野生型prelamin A水平升高的野生型成纤维细胞的转录组。我们随后使用两种表型的正常逆转，减少细胞生长和变形核，通过用法尼基转移酶抑制剂（FTI）处理或ZMPSTE24的过表达，作为过滤策略以鉴定与这两种表型的发作相关的基因。通过该分析，我们鉴定了编码转录因子FOXQ1的基因，其基因的表达在表达progerin和野生型prelamin A水平升高的两种细胞中被诱导，并且随后在改善表型的条件下在两种细胞类型中均被降低。我们在正常成纤维细胞中过表达FOXQ1，并证明该因子水平的增加导致过滤策略中使用的两种特征的发展。这些发现表明这种转录因子与改变的prelamin A代谢诱导的细胞功能障碍之间存在潜在联系。作为过滤策略来鉴定与这两种表型的起始相关的基因。 关键词：保健，疾病，衰老，雷帕霉素 介绍Lamin A是核层的组成部分，其被合成为prelamin A前体，然后经历若干连续的翻译后修饰以产生成熟的核纤层蛋白A.核纤层蛋白A / C基因中的突变与多种病症相关，统称为laminopathies [ 1 ]，其中包括甲状腺疾病哈金森 - 吉尔福德早衰综合征（HGPS）[ 2 ]。HGPS（早老症）和沃纳综合征，也称为成人早衰症，是遗传性疾病，其可提供对正常人类衰老的机制见解[ 3，4 ]。大多数HGPS病例是由核纤层蛋白A / C基因的点突变引起的，这种突变导致永久性法尼基化突变核纤层蛋白A蛋白被称为progerin [5，6 ]。progerin的产生导致几种细胞改变的逐渐出现，这些改变导致加速老化表型的发作。表达异位progerin的早衰细胞和HeLa细胞显示生长缺陷和核膜形态改变。两者的细胞表型可通过抑制法呢基化的通过用法尼基转移酶抑制剂（FTIs）处理来提高7 - 11 ]。最近，一些研究表明用雷帕霉素治疗，促进生长的mTOR信号通路的抑制剂和抗衰老治疗的潜在药物[ 12]]，限制早衰蛋白的积累，改善早衰蛋白表达细胞和救援组织功能的中核纤层蛋白缺陷小鼠[细胞表型13 - 16 ]。这些研究结果表明，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂对早衰和其他可能的椎板病变具有治疗价值[ 17 ]。 我们和其他人已经表明，小的增加在野生型prelamin A的表达足以概括在HGPS细胞中观察到，包括dismophic核和从增加细胞凋亡的发生率和过早衰老导致减少的细胞增殖[蜂窝缺陷11，18 ]。表达progerin或升高水平的野生型prelamin A的细胞在细胞核中显示异常的核纤层蛋白A聚集体，在正常老年个体的细胞中也观察到，但在年轻个体的细胞中不存在[ 11]]。尽管HGPS与正常个体寿命期间相似表型的发生之间的关系尚不清楚，但这些发现表明功能失调的prelamin A加工与正常衰老之间存在一个有趣的联系[ 19 ]。事实上，其他研究表明，在核纤层蛋白通路的改变可能在一般人的衰老[发挥关键作用，20 - 22 ]。 核纤层蛋白A被认为是提供一种用于支撑核膜[的机械框架23，24 ]，并影响染色体和染色质结构，最终影响基因表达的空间组织1，23，25，26 ]。早衰蛋白的积累已被证明导致异和异常端粒长度稳态的水平的降低[ 18，20，27 - 29 ]，并改变基因的表达[ 30 - 33]。然而，尚未建立改变的基因表达与表达功能失调的prelamin A的细胞的表型变化之间的直接关系。 结果鉴定表达progerin或升高水平的prelamin A的细胞中基因表达的变化我们之前已经证明，用FTI处理或增加ZMPSTE24（一种关键的prelamin A加工酶）的表达可以改善细胞增殖，并导致表达升高的prelamin A水平的细胞中具有破坏性细胞核的细胞数量显着减少[ 11]]，表明异常的prelamin A处理是造成这些表型变化的原因。由于progerin的表达或prelamin A的表达增加导致非常相似的细胞表型，我们推断在这些细胞中观察到的细胞改变可能是由共同的分子效应物引起的，其在诱导前代表型中起重要作用。为了测试实验这一假说，我们进行了在同基因正常的人二倍体成纤维细胞系的基因表达谱的微阵列分析，以确定基因，其表达模式在既早衰蛋白或野生型prelamin A（图的水平升高的表达被改变（图1， 1，步骤A）。该分析证明了具有progerin或升高水平的prelamin A的细胞中超过1800个基因的表达（> 2倍; p <0.05）的变化（图S1A）。为了定义基因表达的这些变化如何影响细胞稳态，我们用Database for Annotation，Visualization和Integrated Discovery（DAVID）软件分析了我们的微阵列数据，并鉴定了与许多生物途径相关的基因的富集（图S1B）。值得注意的是，几种途径，包括细胞外基质（ECM） - 受体相互作用和WNT信号传导，这些途径先前已经涉及早衰病理[ 33 ]，在表达progerin或升高的prelamin A水平的细胞之间共享（图S1C））。 一种过滤策略，用于识别核纤层蛋白A功能障碍的效应物（A）用于鉴定FOXQ1作为基因的策略，其表达在表达progerin或升高的prelamin A水平的细胞中改变，并在用FTI或ZMPSTE24过表达处理后逆转正常。（B）在指定的成纤维细胞系中FOXQ1表达的定量RT-PCR分析证实FOXQ1表达在表达升高的prelamin A或progerin水平的细胞中上调，并在用FTI处理或ZMPSTE24过表达后恢复正常。 鉴定通过法呢基转移酶抑制剂（FTI）和ZMPSTE24过表达治疗恢复的基因然后将过滤策略被用来确定一个功能障碍（图核纤层蛋白的潜在关键效应（Figure1A， 1A，步骤B），具体而言，我们搜寻了的基因，其表达恢复对正常治疗法尼基转移酶抑制剂两种细胞系的后（FTIs在ZMPSTE24过表达后，在野生型prelamin A水平升高的细胞中（图S2和S3））。通过这一分析，我们确定了一个编码叉头转录因子FOXQ1的基因，它是在表达progerin的细胞和野生型prelamin A水平升高的细胞中诱导表达的唯一基因，随后在两种细胞类型中均向正常方向降低。经过处理可以改善生长和核膜形态的缺陷。FOXQ1的差异表达通过定量逆转录酶聚合酶链反应（RT-qPCR的）分析（图验证（Figure1B）。 1B）。FOXQ1是转录因子的叉头家族已经在上皮细胞形态和分化[调控牵涉的特征在于差的部件34，35 ]。 FOXQ1在人二倍体成纤维细胞中的异位表达损害增殖并导致畸形核要定义FOXQ1以及由功能失调prelamin的处理诱导的早衰特征的发展之间的功能性连接，我们在正常人二倍体成纤维细胞过表达FOXQ1和监测细胞培养物中在几个传代（图生长和核形态（图2）。 2）。引人注目的是，我们注意到FOXQ1的表达增加伴随着增殖速率的降低以及与对照细胞相比，在几次传代后具有变形细胞核的大量细胞（图2B-D）。重要的是，这些变化是定性和定量地类似于在早老症细胞中观察到，细胞异位表达早衰蛋白和细胞具有升高水平prelamin A的（图（图2） 2）[11]。生长抑制仅限于原代细胞，因为FOXQ1以及progerin的表达不影响包括HeLa和HEK293的转化细胞的生长（数据未显示）。在过量表达FOXQ1的细胞中存在核起泡是显着的，因为这是具有改变的核纤层蛋白A功能的细胞的突出特征[19]。 FOXQ1在正常人二倍体成纤维细胞中的异位表达导致生长速率降低和核膜形态改变，在表达progerin或升高的prelamin A水平的细胞中观察到两种表型。（A）裂解表达标记标记的FOXQ1，progerin或prelamin A的人二倍体成纤维细胞，并通过用flag抗体进行免疫印迹分析。抗甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的抗体用作上样对照。（B）用慢病毒转导正常人二倍体成纤维细胞，用于表达标记标记的FOXQ1，progerin或prelamin A，并在几次传代中监测细胞生长。对照细胞系代表用慢病毒转导的用于表达GFP的人二倍体成纤维细胞。（C）如材料和方法部分中所述测定每个实验样品中第3代和第4代具有变形核的细胞的百分比。（D.代表性图像DAPI染色的对照细胞核和过表达progerin或FOXQ1的细胞显示出改变的核形态。箭头指的是核起泡的例子。 讨论表达progerin的成纤维细胞的不良增殖是过早衰老和凋亡的结果[ 11 ]，表达progerin或升高水平的prelamin A的细胞的两个关键特征可能有助于HGPS的早衰表型。progerin或部分加工的prelamin A的积累如何导致细胞功能障碍的过早发作尚不清楚，但可能与基础核过程的改变有关。 在这里，我们实施了一个严格的筛选，以确定其表达改变可能导致由功能失调的prelamin A加工诱导的缺陷表型发作的基因。为此，我们比较了表达与早老素相关的核纤层蛋白A的突变形式（称为progerin）或野生型prelamin A水平升高的同基因成纤维细胞的转录组与野生型成纤维细胞的转录组。我们随后通过用法呢基转移酶抑制剂（FTI）和ZMPSTE24过表达作为过滤策略来鉴定关键的下游效应物，将两种表型，细胞增殖和核膜形态的逆转转向正常。该分析鉴定了FOXQ1，一种编码叉头转录因子的亚端粒基因，作为唯一统计学上显着的基因，其表达在表达progerin的细胞和野生型prelamin A水平升高的细胞中被诱导，随后在用FTI处理后在两种细胞类型中以及在ZMPSTE24后表达升高的lamin A水平的细胞中减少。过表达。引人注目的是，FOXQ1在正常人成纤维细胞中的异位表达导致两种特征的发展，这些特征用于过滤策略（生长缺陷和核膜形态的改变），其定性和定量方式类似于具有功能失调的prelamin A的细胞中观察到的特征。处理。然而，在siRNA下调FOXQ1后，我们没有观察到表达progerin的细胞的生长和核膜形态的显着改善（数据未显示）， 虽然FOXQ1与衰老相关的病理学之间没有先前的联系，但有研究表明，FOXO是叉头转录因子的一个亚家族，可以对抗与年龄相关的疾病，包括糖尿病，癌症，自身免疫综合征和神经退行性疾病[ 36]。 ]。FOXOs抑制mTOR [ 37，38 ]，用于靶向治疗[潜在基底17 ]; 因此，操纵FOXO功能可为HGPS提供临床益处。FOXQ1是否影响mTOR功能仍有待确定。 核纤层蛋白A和染色体和早衰蛋白的积累相互作用已经显示出导致外围异，具有失活的X染色体相关[异损失的水平降低27，28 ]，异染色质标记物的重定位或降低水平，包括异染色质蛋白1A （HP1a），组蛋白H3上的三甲基化的赖氨酸9（H3K9-3me）和组蛋白H3上的三甲基化的赖氨酸27（H3K27-3me）[ 20，28，39，40]。这些发现表明，由progerin引起的表观遗传改变可能诱导特定基因表达的变化，这有助于缺陷表型的发作。这些表观遗传变化可能仅限于基因启动子，或者因为核苷酸与核内染色体结构域的定位有关[ 41 ]，因染色体空间分布的改变而包含大的染色体区域。事实上，比较基因组杂交研究表明，细胞核分裂功能的破坏会不同地影响染色体重新定位到核“疱疹”位点[ 42]]。有趣的是，编码FOXQ1的基因位于染色体臂6p的亚端粒结构域，这是一种染色体臂，在由纤维缺陷诱导的核膜泡中持续过量[ 42 ]。 从HGPS患者和正常对照细胞之间基因表达的变化已经报道了30 - 32 ]。然而，已观察到差异表达基因的身份的重叠非常少，可能表明用于这些研究的细胞系中的遗传异质性影响了分析的结果。或者，progerin可以诱导影响不同基因组的随机表观遗传改变，每个基因组以不同的方式促成孕激素表型的发作。 方法细胞培养来自健康新生儿（GM00038和AG12945）的原代真皮成纤维细胞系，来自Coriell Cell Repository。HeLa和HEK293细胞获自ATCC（CRL-1573）。细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养，培养基中添加15％胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，100 U mL -1青霉素和100μg/ mL链霉素，37°C，5％CO2和3％ O2。当培养物达到85％汇合时，以每100mm直径培养皿1.4×105接种的细胞进行传代。通过使用公式（log H -log S）/ log 2 计算累积的群体倍增来测量细胞生长，其中log H是收获的细胞数和log S的对数。如[ 11 ]中所述，是每次传代第一天播种的细胞数的对数。如[ 11 ] 所述，用FTI和ZMPSTE24过表达处理成纤维细胞系。 RNA分离使用来自QIAGEN的RNeasy试剂盒，根据制造商的方案，在第10代从每个成纤维细胞系分离总RNA，并通过使用NanoDropTM 1000分光光度计评估260和280nm处的吸光度进行定量。然后将3微克总RNA提交给洛杉矶儿童医院的南加州大学Affymetrix MicroArray核心设施进行处理，芯片杂交和扫描。在Affimetrix基因芯片Human Genome U133 Plus 2.0 Array上分析基因表达，其在单个阵列上提供全面的全基因组表达，具有超过47,000个转录物和变体，包括38,500个表征良好的基因。使用Fluidics Station 400（Affymetrix）洗涤并染色芯片，并使用G2500 GeneArray Scanner（Hewlett-Packard）检测荧光。 微阵列数据分析最初使用Microarray Suite 5.0版（MAS 5.0，Affymetrix）分析原始数据，其用于质量控制分析，将所有值扩展至目标值（250），并生成“缺失”基因的列表。如果GAPDH和β-肌动蛋白的3'/ 5'比率小于3，则阵列被判断为可接受进行额外分析，并且发现“存在”的基因百分比在阵列与阵列之间相似。使用Microarray Suite 5.0（MAS 5.0）进行微阵列数据的低水平分析（背景校正，标准化和基因概括）。使用制造商的检测调用的默认阈值分析各个阵列并使用MAS 5.0进行缩放以获得强度信号，检测p值和信号对数比。http://）。S值得分p值为0.01用作阈值。将Affymetrix GeneChips之间的P值高于0.01过滤掉，并且不包括在后续分析中。使用Microsoft Excel获得基因列表，以根据倍数变化过滤具有显着p值的阵列之间的差异，并揭示显着恢复的基因。微阵列实验符合MIAME指南，并且已将完整的数据集提交给国家生物技术信息中心（NCBI）基因表达综合数据库（GEO）。 途径分析使用注释，可视化和集成发现（DAVID）软件（http://david.abcc.）数据库来比较共表达相互作用与从文献中手动策划的交互信息，并注释这些交互与最匹配的生物学功能。该软件包利用来自文献的信息来识别基因与各种生物过程和分子功能之间的功能关系。 定量RT-PCR使用BIORAD iCycler仪器进行定量逆转录PCR（qPCR）。使用RNeasy试剂盒（Qiagen，Valencia，CA，USA）根据制造商的说明提取和纯化来自每种细胞系的RNA。对于每个样品，使用来自Amersham Biosciences的第一链cDNA合成试剂盒在37℃下在65℃变性10分钟后转录3μgRNA。用于特异性检测FOXQ1的引物是：（FOXQ1-428F：5'-CGGAGATCAACGAGTACCTCA-3'; FOXQ1-591R：5'-GTTGAGCATCCAGTAGTTGTCCTT-3'）。甘油3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）用作内标。（GAPDH）引物用于标准化（GAPDH-F：5'-CCACCCATGGCAAATTCCATG-3'; GAPDH-R：5'-TGATGGGATTTCCATTGATGAC-3'）。在2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并用溴化乙锭染色。根据制造商的说明，iQ SYBR Green与MyiQ软件一起用于实时PCR。所有PCR效率均> 95％，并使用标准曲线测定每种引物组。 质粒和稳定转导的细胞系的产生人FOXQ1 cDNA购自ATCC（10436949）并使用以下引物通过PCR克隆到pCR4-topo载体中：5'-CATATGAAGT：TGGAGGTGTTCGTC-3'，5'-TCTAGATCAGGCTAC GAGCGTCTC-3'。通过DNA测序验证序列准确性。将FOXQ1 cDNA亚克隆到pVL1393-Flag载体的Nde1-EcoR1位点（Comai等，1994）。然后将Flag标记的FOXQ1 cDNA亚克隆到慢病毒转移载体pkey204 MSH2-IRES-GFP 的BamHI / XbaI位点以产生pkey-FlagFOXQ1。将Progerin，prelamin A和FOXQ1亚克隆到含有慢病毒载体pRRL.sin.CMV.flag.sv40.puromycin的CMV启动子的Nde1 / EcoR1位点。如前所述产生重组慢病毒[ 44]。对于慢病毒感染，将磷酸钙转染的293T细胞培养物用胰蛋白酶消化，接种到100-mm平板上，并在37℃下孵育24小时。收集含有病毒颗粒的上清液，过滤并将等体积的每种病毒上清液加入到约40％汇合的正常人成纤维细胞培养物中。在37℃温育6小时后，除去上清液，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次，并在含有10％血清的DMEM中于37℃温育。通过荧光激活细胞分选选择表达GFP的转导细胞。通过用flag抗体（Sigma，St.Louis，MO，USA）进行免疫印迹分析flag标记的蛋白质的表达。每种慢病毒在两个独立的成纤维细胞系中转导，每个细胞系一式两份生长。 核形态分析通过DAPI染色细胞的荧光显微镜分析核形态。在每次传代时，将2.3×10 3个细胞接种在带腔室的载玻片中并进行分析。将细胞在PBS中洗涤并在室温下使用4％多聚甲醛固定5分钟。然后将固定的细胞再次在PBS中洗涤，并在透化溶液（0.1％Triton X-100,0.1％柠檬酸钠）中在冰上孵育5分钟。然后将细胞用PBS和DAPI（1微克毫升洗涤-1在PBS中）在黑暗中加入1分钟。随后将细胞在透化溶液中洗涤，然后用PBS洗涤以除去洗涤剂。然后用抗褪色试剂处理每个载玻片并使其在黑暗中干燥。用荧光显微镜在x200，x400和x1000放大倍数下分析核形态。带有气泡的细胞核被认为是具有一个或多个分叶的细胞核，导致畸形的细胞核。在每次传代时，两个独立的观察者为每个细胞系评分300个细胞。 蛋白质印迹分析将人成纤维细胞在PBS中洗涤两次，收集，并在SDS样品缓冲液中于95℃裂解5分钟。通过SDS-PAGE分离细胞提取物并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用抗FOXQ1（山羊多克隆; Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA，sc-47596），抗GAPDH（山羊多克隆; Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA，sc-20357）探测印迹，和抗Flag（小鼠单克隆，Sigma，F-3165）。用适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗（Pierce，Rockford，IL，USA）检测免疫反应条带，并通过增强的化学发光（Amersham，Piscataway，NY，USA）显现。 统计分析我们使用Student's t检验对细胞系和GFP对照之间的差异进行统计分析。我们使用Microsoft Excel计算学生的t检验和标准偏差。 致谢我们要感谢Angel Mei和Stacey Borrego的技术支持以及Reddy和Comai实验室的成员进行有益的讨论。该研究得到了Zumberge创新基金（LC）和NIH（F31GM076861）到JC的Predoctoral奖学金的支持，并在研究设施改进计划拨款号C06 RR014514-01，C06 RR10600-01和C06 CA62528来自美国国立卫生研究院国家研究资源中心。 参考Broers JL，Ramaekers FC，Bonne G，Yaou RB，Hutchison CJ。核纤层蛋白：椎板病及其在早衰中的作用。Physiol Rev. 2006; 86：967-1008。[ PubMed ] Ackerman J，Gilbert-Barness E. 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