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Western blot是我们检测蛋白是否表达以及表达相对变化最常用的方法。WB实验说起来很简单，很多科研者也经常在做，但是不少人还是会碰到各式各样的问题- 高背景，无条带，杂带太多，假阳性，假阴性等等。当然，WB结果出现问题可能是很多原因引起的，但如果我们在实验开始是就设置好严谨的参照体系，不仅会降低问题出现的几率，即使出现了问题，我们也可以快速查出问题出现的原因，解决起来得心应手，少走弯路。 通常WB的对照体系包括：蛋白Marker，内参和正负对照。  我们先来说一下蛋白Marker，它用来指示蛋白条带对应的分子量大小，也可以作为凝胶电泳进程和WB转膜效率的指示剂。正确选择蛋白marker看似是个小环节，实际上是WB成功的必要条件之一。如何判断选择的蛋白Marker是否合适？ 1 考虑蛋白Marker分子量范围：从实验室总体考虑，尽可能选择分子量范围比较广的蛋白marker，以便适用于更多蛋白的检测。当然，如果已经确定集中在大分子量蛋白或小分子量蛋白的检测，最好选择对应分子量范围的marker，以便获得更好的指示。如Merck提供的超低分子量蛋白Marker（#C6210）在1-26KD之间有6条带，可以清晰的指示小分子量蛋白。 2 考虑使用预染蛋白Marker：因为预染Marker在电泳或转膜过程中可以被直接观察到，方便我们判断电泳的进程，如电泳是否发生异常或是否将目标蛋白完全分开等，也可以判断转膜的是否完全，转膜后还可以直接在膜上标记蛋白分子量。 3 考虑Marker条带数是否在分子量范围内分布均匀，没有广泛的空白区域。是否多种颜色，以便于快速识别不同的分子量大小。此外，五颜六色的Marker也为实验结果添加一抹亮色。还要注意选择条带锐利清晰的Marker，这样才能更精确的指示蛋白的分子量。  以下为大家推荐几款蛋白Marker👇  另一个经常被实验者忽略确实WB实验成功要素之一的就是内参抗体的选择。我们通常选择持家基因作为WB的内参。持家基因(house-keeping genes)：又称管家基因，是指所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。 内参能够校正WB上样过程中的实验误差，使来源于不同处理条件或不同组织的样本在等量的细胞前提下进行目的蛋白表达量的比较。在发表文章时，内参也是WB实验结果的重要组成部分，如果没有内参结果，或内参结果有异议，文章都有可能被拒哟～ 既然内参在WB实验中这么重要，下面小编就告诉大家如何在WB实验中正确的设置内参吧～ 1 根据实验样本的种属选择适合的内参。如哺乳动物组织或细胞通常用b-actin，GAPDH和β-Tubulin等作为内参。如果是植物样本，可以选用Plant actin、Rubisco等。 2 根据目的蛋白的表达位置选择合适的内参。如要检测全细胞或细胞质中的蛋白表达，可以选择b-actin，GAPDH和β-Tubulin作为内参，如要检测细胞核中的蛋白，可以选用PCNA和TBP作为内参，线粒体蛋白的内参选择COX IV、VDAC1/Porin，胞膜蛋白内参Na+/K+-ATPase 等。 3 一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，以防止条带互相影响。 4 选定适合的内参后，针对内参的抗体选择也是非常重要的。由于内参基因持续高表达，内参结果往往比较容易获得，所以市场上内参抗体的质量往往参差不齐，实验者在选择抗体时一定要擦亮眼睛，切不可贪便宜而造成整个WB实验的失败。 另一方面，内参抗体也存在“组织特异性”，比如b-actin,有些公司提供的是仅针对N-端或C-端的抗体，而在有些组织中用N-端的抗体就检测不到b-actin。所以实验者选择抗体时这个因素也要考虑进去。 说了这么多，那靠谱的内参抗体哪里找？ 你往下看👇 默克整合了Sigma, Chemicon, Upstate, Linco, Calbiochem等多个子品牌，为科研工作者提供超过9万种抗体，覆盖十几个热门研究领域。在内参抗体方面，默克提供包括b-actin，GAPDH，β-Tubulin等抗体在内的近千种抗体。下面给大家推荐一些高文献引用率的内参抗体。  最后小编再悄悄告诉你个好消息  即日起-5月31日 购买蛋白Marker和内参抗体 满额即赠精美礼品哟～ 1000-5000元，卡通积木万年历，天气预报投影时计， LED护眼灯 5000-15000元，KAPPA多功能炫彩运动杯，多功能电源暖手宝，蓝牙音乐耳机 15000元以上，膳魔师焖烧罐，多彩医用冷藏箱，小米手环 |
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